DB44∕T 664-2009 鹅的禽副粘病毒病与高致病性禽流感(H5亚型)的H1和多重RT-PCR鉴别诊断技术操作规程(广东省).pdf
《DB44∕T 664-2009 鹅的禽副粘病毒病与高致病性禽流感(H5亚型)的H1和多重RT-PCR鉴别诊断技术操作规程(广东省).pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《DB44∕T 664-2009 鹅的禽副粘病毒病与高致病性禽流感(H5亚型)的H1和多重RT-PCR鉴别诊断技术操作规程(广东省).pdf(10页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、ICS 65.020.30 B 41 备案号25946-2009DB44 广东省山巳T目,万标准DB44/T 664-2009 鹅的禽副粘病毒病与高致病性禽流感(H5亚型的HI和多重RT-PCR鉴别诊断技术操作规程HI and mu1tiplex RT-PCR for detection and differentiation between GPMV and H5 subtype of AIV in goose 2009-08-06发布2009-12-01实施广东省质量技术监督局发布目IJ1=1 本标准附录A、附录B和附录C为规范性的附录。本标准由广东省农业厅提出井归口。本标准起草单位:华南
2、农业大学兽医学院。DB44/T 664-2009 本标准主要起草人:任涛、徐成刚、罗开健、曹伟胜、袁少华、廖明、张桂红、辛朝安。DB44/T 664-2009 鹏的禽副粘病毒病与高致病性禽流感(H5亚型)的HI和多重RT-PCR鉴别诊断技术操作规程1 范围本标准规定了应用血凝抑制试验(HI试验)和反转录一聚合酶链式反应(RT-PCR)技术鉴别诊断鹅的禽副粘病毒病与H5禽流感的材料准备、操作方法及结果判定。本标准适用于鹅的禽副粘病毒病与高致病性禽流感(H5亚型)的鉴别诊断。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的号|用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误
3、的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。GS/T 18936 高致病性禽流感诊断技术。3 术语和定义GB/T 18936确定的以及下列术语和定义适用于本标准。3. 1 鹏的禽副粘病毒病是近年来的新病,是由鹉的禽副粘病毒(GooseParamvxovirus ,GPMV)引起的鹅的一种高发病率、高死亡率的烈性传染病,以消化道充血、出血为特征的急性传染病。3. 2 高致病性禽流感High1y Pathogenic Avian Tntluenza Virus 是由正主古病毒科流感病毒属的禽类
4、高致病性A型流感病毒(主要为H5亚型)引起的一类急性、高接触性的禽类烈性传染病,具有高发病率和高死亡率的|临床特征。3. 3 红细胞凝集试验是指感染禽类的某些病毒与红细胞发生结合出现红细胞凝集的现象。3. 4 血;疑效价是指红细胞凝集试验中出现红细胞凝集现象的最高稀释倍数,一般以log2为单位。3.5 红细胞凝集抑制试验即HI试验,是指使用特异性免疫血清可以抑制某些感染禽类的病毒与红细胞凝集的现象。3.6 血;疑抑制效价是指HI实验中不出现红细胞凝集现象的最高稀释倍数,一般以log2滴度为单位。3. 7 四单位抗原根据抗原HA效价结果进行稀释,配制出血凝效价为2个log2单位的抗原稀释液。DB
5、44/T 664-2009 3. 8 反转录聚合目酶每链反应R巳盯 ve阳e创rse是指利用反转录酶将病毒RN阳A反转录成cDNA,再以cDNA为模板进行PCR扩增的检测方法。RT-PCR使RNA检测的敏感性提高了几个数量级,使一些极为微量的RNA样品分析成为可能。3. 9 特异性引物是指针对特定模板DNA基因片段设计的一小段与DNA片段两侧互补的人工合成寡核昔酸。3.10 无RNase水是指除去RNA酶活性的双亲水。4 HI试验4.1 仪器设备及材料4. 1. 1仪器设备:离心机,最大转速至少应达到5000g;微量振荡器96孔V型板5L50L八道移液器。4.1.2 材料lmL、10mL吸管1
6、0mL离心管2mL一次性注射器。pH值为7.4,浓度为O.01mollL的磷酸盐缓冲溶液(PBS)3.8%拧撮酸纳抗凝剂1%鹅红细胞悬液GPMV和HPAIV抗原、标准血清以及阴性血洁。试剂的配方见附录B4. 2 采样与样品制备:每只鹅心脏或翼下采血lmL2mL静置或离心,待血洁忻出后备用。4.3操作规程4.3.1 HA效价的测定在96孔V型反应板的l孔12孔均加入25LPBS,换吸头:吸取GPMV或HPAIV25L于第l孔中混匀后吸出25L至第2孔,依次倍比稀释到第11孔,从第11孔吸取25L弃去并换吸头;同样,换吸头后取25LAIV进行在另外一排孔中进行同样的操作,有必要的话,每种抗原可以重
7、复做一排:每孔加入25LPBS; 吸取1%鹅红细胞悬液依次加入各孔,每孔25L;置于微量振荡器上振荡30s,室温(200C250C)静置40min后观察结果:对照孔C121U红细胞应成明显纽扣状沉到孔底,此时根据完全血凝的最高稀释倍数得出HA效价。4.3.2 四单位抗原校正用微量移液器向反应板的2孔6孔加PBS25L,第1孔不加:根据4.3.1HA效价的测定结果配制四单位GPMV及HPAIV抗原,用微量移液器吸取25L四单位抗原分别加入第1孔、第2孔中,从第2孔开始混匀后吸出25L至第3孔,依次倍比稀释到第5孔,弃去2.5L;每孔加入2.5LPBS;用微量移液器再吸取1%鹅红细胞悬液依次加入l
8、孔6孔,每孔2.5L;于微量振荡器上振荡30s;室温(200C250C)静置40min后观察结果:如第l、2、3孔为完全凝集,第4孔红细胞为50%沉淀,第5孔红细胞产生75%的沉淀,第6孔为对照完全沉淀,出现以上结果,表明所配四单位抗原准确,校正成立。否则,重新测HA效价并且配制四单位抗原,然后再做校正直至出现以上结果。4. 3. 3 HI 试验每排孔检测l份血洁,同时设立阳性血清对照和阴性血清对照,试验步骤如下:在微量反应板的1孔11孔加入25LPBS,第12孔加入50LPBS;吸取待检血清25L置于第1孔中,1昆匀后吸取25L于第2孔,依次倍比稀释至第10孔,从第10孔吸取25L,弃去1孔
9、11孔均加入4.3. 2中配制好的四单位抗原25L,室温(200C250C)静置至少30mino吸取1%鹅红细胞悬液依次加入各孔,每孔25L;置于微量振荡器上振荡30s,混合均匀,室温(200C250C)静置40min后观察结果。4. 4 结果判定将反应板倾斜成450角,只有抗原对照孔(1日U红细胞将成明显的纽扣状沉淀,红细胞对照孔(12孔)成泪滴状流淌,才可以进行HI结果的判定。同时,只有阴性对照孔血清效价不大于210品,阳性对照孔血清2 DB44/T 664-2009 误差不超过1个10g二,试验结果才有效。HI效价小于或等于310g二判定HI试验阴性HI效价等于41og判定为可疑,需重复
10、试验HI效价大于或等于51og判定HI试验阳性。5 RT-PCR实验5. 1 仪器设备及材料5. l. 1仪器设备:生物安全拒PCR仪:电泳仪:凝胶成像系统;小型台式高速低温离心机:水浴锅。5. l. 2耗材:微量移i夜器(配有滴头);0.5mL或O.2mL PCR反应管:一次性手套1.5mL灭菌离心管。5. 2 材料5. 2. 1 RNA提取试剂:氯仿(分析纯或以上试剂);DEPC处理的无RNase去离子水:异丙醇(分析纯或以上试剂);无RNase水配制的75%乙醇:反转录随机引物(pd(N) 6, 20Jlmol/L)、AMV反转录酶、核糖核酸酶抑制剂(RNasin)Ex-Taq酶2.5m
11、mol/LdNTP 1昆合物:凝胶加样缓冲液1XTri s-jj(乙酸电泳缓冲液:10mg/mL澳化乙皖(EB)l. 0%琼脂糖凝胶(含O.5g/mL EB) DNA分子量标准(DL2000)PCR扩增引物(浓度分别为25pmol/L,见附录B.l)。试剂的配制见附录Bo5. 2. 2病料的处理:按照国标GB/T18936的2.1进行。5.3 操作规程5.3.1核酸抽捏取250L5.2.2中制备的病料组织上清液,置于一灭菌的1.5mL离心管中,同时设立阴性对照及鹅的禽副粘病毒、H5亚型禽流感病毒阳性对照,再分别加入冰冷的裂解液750L,剧烈混合样品15s,室温放置5mino加入200L氯仿,反
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- DB44T 664-2009 鹅的禽副粘病毒病与高致病性禽流感H5亚型的H1和多重RT-PCR鉴别诊断技术操作规程广东省 DB44 664 2009 副粘病毒 致病性 禽流感 H5 H1 多重
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【曲****】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【曲****】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。
链接地址:https://www.zixin.com.cn/doc/187518.html