GB∕T 40226-2021 环境微生物宏基因组检测 高通量测序法.pdf
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1、ICS 07.080 CCS A 40 中华人民共和国国家标准GB/T 40226-2021 环境微生物宏基因组检测高通量测序法Detection of environmental microbial metagenome-High throughput sequencing 2021-05-21发布国家市场监督管理总局申+国家标准化管理委员会保W2021-12-01实施GB/T 40226-2021 目次皿11122222件文用义引定-u件u备性和语条设围范语略理验剂器言范规术缩原试试仪斗目123456789 样品310 试验步骤11 试验报告412 质量控制附录A(规范性)粪便样品采集、保
2、存、运输方法附录B(规范性)土壤样品采集、保存、运输方法附录c(规范性)水体样品采集、保存、运输方法8附录D(资料性)样品信息单附录E(资料性)DNA样品的完整性图谱和质量级别分类10附录F(资料性)参考数据库u参考文献. . . . . . . . . . . . . . . . 12 I GB/T 40226-2021 目。吕本文件按照GB/T1.1-2020(标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国生化检测标准化技术委员会CSAC/TC387)提出并归口。本文件起草单位:深圳华大生
3、命科学研究院、深圳华大基因科技有限公司、深圳市生命科技产学研资联盟、中国测试技术研究院生物研究所、深圳华大临床检验中心。本文件主要起草人:陈冰、肖亮、钟焕姿、李俊桦、李倩一、贾慧在、姜华艳、周李华、唐美芳、吴吴、李陶莎、周援、钟宏彬。mu GB/T 40226-2021 环境微生物宏基因组检测高通量测序法1 范围本文件描述了采用高通量测序技术进行环境微生物宏基因组检测的术语和定义、原理、试验条件、试剂、仪器设备、样品、试验步骤、试验报告和质量控制要求。本文件适用于运用高通量测序法进行环境微生物宏基因组的检测。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中
4、,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析试验室用水规格和试验方法GB 19489 实验室生物安全通用要求GB/T 35537-2017 高通量基因测序结果评价要求3 术语和定义3.1 3.2 3.3 下列术语和定义适用于本文件。环境environment 相对某项中心事物的周围世界。注:在本文件中特指人体(动物)环境与自然环境。人体(动物)环境包括但不限于口腔、皮肤、生殖道、肠道等;自然环境包括但不限于空气、水体、士壤、沉积物等。相对丰度relative abundance 某一特定种类微生物在
5、环境微生物群落中所占的相对比例。注:通常以百分比表示。微生物宏基因组microbial metagenome 以特定环境中整个微生物群落作为研究对象,不分离培养,直接提取得到的所有微生物基因组DNA。3.4 注:可用于分析其遗传信息、物种分类、系统进化、基因功能及代谢网络等。碱基识别质量quality of base calling 评价碱基准确识别的概率。注:简称为Q,通常以数值表示。碱基识别质量值与碱基识别错误率负相关,二者遵循对数函数关系。碱基识别质量值越高,错误率越低。GB/T 40226-2021 3.5 Q20 测序数据中,碱基识别质量值为20的碱基识别准确率为99%,或错误率为1
6、%。3.6 Q30 测序数据中,碱基识别质量值为30的碱基识别准确率为99.9%,或错误率为0.1%。4 缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) ID:识别码(identifier)PCR:聚合酶链式反应(polymerasechain reaction) RNA:核糖核酸(ribonucleicacid) 5 原理运用高通量测序技术对环境样品中微生物基因组DNA进行测序,再将测序结果与现有数据库中序列进行比对,从而检测样品中所含微生物种类和相对丰度。6 试验条件6.1 实验室设施和设备要求应符合GB19489的规定。6.2 实验室用水应
7、符合GB/T6682的规定。6.3 实验室应做到防止污染,应根据不同工作内容划分独立区域,并有明显标志,如试剂储备和准备区、样品制备区、扩增区等,各区域间应避免交叉污染。7 试剂7.1 DNA提取试剂。7.2 PCR产物纯化试剂o7.3 文库制备试剂。7.4 高通量测序试剂。8 仪器设备8.1 高通量测序仪。8.2 PCR仪。8.3 冷冻离心机:最大离心力12OOOg以上。8.4 微量移液器。8.5 紫外分光光度计。8.6 荧光定量仪。2 8.7 电泳仪。8.8 凝胶成像系统。8.9 水浴锅。8.10 低温冰箱:-20 oc和80 oc。9 样晶9.1 样品采集、保存和运输9.1.1 样品采集
8、应经过伦理审查和生物安全评价审查。GB/T 40226-2021 9.1.2 应即刻采样,减少样品暴露于空气中的时间,同时应避免样品被其他物质污染。9.1.3 应根据环境样品类型等情况选择相应的采样方法以保证样品中微生物群落的代表性和准确性。粪便样品采集、保存和运输方法按附录A,土壤样品采集、保存和运输方法按附录B,水体样品采集、保存和运输方法按附录C执行。9.2 样品接收与处理应核对样品编号,记录样品信息,检查样品状态,避免密封不严导致、泄漏或污染等,否则该样品应废弃,重新采样。应记录样品信息(见附录D),以保证样品的可追溯性。10 试验步骤10.1 DNA提取10.1. 1 原理将环境样品
9、悬浮于裂解缓冲液中,通过抽提等步骤提取微生物基因组DNA,充分去除样品中的蛋白质、脂类、多糖、RNA等杂质。宜选用于工提取方法或相应DNA提取试剂盒。10.1.2 DNA样品浓度和完整性检测环境样品提取微生物基因组DNA后,应使用荧光定量仪检测DNA样品浓度,使用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA样品完整性。宜综合DNA样品浓度及完整性,判断DNA样品质量级别,判断依据见附录E。10.2 文库构建与高通量测序10.2.1 应使用合适的DNA样品和文库构建试剂进行文库构建。进行文库构建的DNA样品类别选择标准按表1。表1进行文库构建的DNA样品类别选择标准DNA样品类别是否满足文库构建A类满足文库构建要
10、求.DNA总量二三1.0gB类满足文库构建要求.DNA总量二三0.5g.且.1.0gC类不完全满足文库构建要求,可以尝试进行该步骤,但不保证测序质量。建议重新采样,重新提取样品微生物基因组DNAGB/T 40226-2021 10.2.2 应使用合适的文库和高通量测序试剂进行高通量测序。高通量测序按GB/T35537-2017的附录A进行。10.3 数据处理10.3.1 数据质控10.3.1. 1 质控步骤样品经过高通量测序得到的原始数据,应进行质量控制,去除含接头或低质量的序列、外源或宿主基因组序列,再进行后续生物信息学分析。10.3.1.2 碱基识别质量值要求测序完成后,应进行Q20、Q3
11、0的统计和评估。每个DNA样品可用数据对应的碱基识别质量值应符合如下要求:大于Q20的碱基比例二三90%; 大于Q30的碱基比例二三80%。10.3.1.3 可用数据量要求可用测序数据量应达到声明目标物种可从样品中检测到的最小测序数据量。每个样品测序生成的可用高质量序列数目应大于1X 107条。注:序列数目为单端测序序列条数,或双端测序序列对数。10.3.2 物种注释数据质控后对样品数据进行物种注释。除特殊方法外,对于已知物种,宜使用数据库中序列相似度95%以上,覆盖度90%以上的物种信息进行注释。数据库见附录F。10.3.3 序列拼接与组装数据质控后对样品数据可进行序列拼接与组装。使用组装软
12、件将序列进行拼接,得到更长的叠连群,将这些叠连群片段聚集起来,与参考数据库进行比对,得到新的参考基因集。数据库见附录F。10.3.4 微生物物种相对丰度计算数据质控后对样品数据进行物种相对丰度计算,应对所使用的相对丰度计算方法进行记录。除特殊方法外,宜将可用高质量测序数据比对到组装好的参考基因集或合适的数据库上,按相似度95%以上,覆盖度90%以土进行统计,得到基因水平上的相对丰度分布情况,再将注释到同一物种分类水平的基因序列相对丰度进行叠加,得到该物种的相对丰度结果。11 试验报告试验报告应包含环境样品中微生物群落的物种组成及各成分相对丰度,可增加个性化功能分析部分,并应至少包括下列内容:a
13、) 检测机构名称、联系方式和地址、检测员、样品接收时间、样品检测时间及报告时间;b) 测序平台与测序策略;4 GB/T 40226-2021 c) 数据分析对应使用的注释方法、软件、参数、流程和数据库版本等;d) 样品物种组成及各相应丰度,宜选择多元展现方式。12 质量控制12.1 宜使用标准物质进行质量控制,评估定性与定量检测结果的准确性。12.2 在描述结果时应注明检测结果的局限性,说明非本文件规定的可能影响检测结果的所有操作细节。GB/ T 40226-2021 A.1 粪便杯采集法A.1.1 采集附录A(规范性)粪便样晶采集、保存、运输方法应使用洁净的器皿收集粪便样品,确认器皿中无水、
14、尿液或其他分泌物(如经血)等污染。排便后即刻使用一次性粪便杯配套取样勺对粪便样品中部取样,将粪便样品从洁净器皿转移至粪便杯,立刻旋紧盖子。每个粪便杯中转移至少2cm3大小的粪便样品。A.1.2 保存与运输A.1.2.1 粪便杯采集粪便样品后,应立即置于干冰或80 oc保存。若不 能即刻转移,可暂存于4oc 条件下(如冰盒),30 min内转移至干冰或80 oc保存。A.1.2.2 应在干冰条件下进行运输。保存及运输过程应避免反复冻融。A.2 含稳定液自采样套装采集法A.2.1 采集应使用洁净的器皿收集粪便,确认器皿中无水、尿液或其他分泌物(如经血)等污染,按照自采样套装操作要求取中段粪便,将采
15、集的粪便样品迅速转移至含有稳定剂的保存管中,使稳定液完全浸没粪便样品,盖紧管盖。A.2.2 保存与运输含稳定液保存管采样后,该保存管按操作说明可于常温保存和运输,避免阳光直射。常温放置时间应不超过自采样套装操作说明限定的常温保存时间范围。对将超出自采样套装操作说明限定时间的常温粪便保存管需转移至80 oc冻存,应在干冰条件下进行运输。保存及运输过程应避免反复冻融。6 B.1 采集附录B(规范性)土壤梓晶采集、保存、运输方法GB/T 40226-2021 宜取土壤表层5cm10 cm处土壤,如果土壤有翻动,应更深处采样,避免空气微生物污染。采样区内设置至少3个重复采样点,保证所取样本对所在地域的
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