竞争放射分析放射免疫分析.ppt
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1、竞争放射分析竞争放射分析l放射免疫分析放射免疫分析 (Radio Immuno Assay,RIA)l竞争性蛋白结合分析竞争性蛋白结合分析 (Competitive Protein Binding Assay,CPBA)l放射受体分析放射受体分析 (Radio Receptor Assay,RRA)优点:优点:1、灵敏度高 3、应用范围广 2、特异性强 4、操作简单缺点:缺点:1、生物试剂,稳定性受多因素影响 2、灵敏度难以超过ag水平竞争放射分析的原理竞争放射分析的原理l*P+Q=(*PQ)+*P +P=(PQ)+P *P :标记物标记物 P :未标记物未标记物 Q :特异性结合剂特异性结合
2、剂放射免疫分析原理l*Ag+Ag+Ab=(*AgAb)+(AgAb)+*Ag+Ag 0 Max Min 条件:条件:1、*Ag定量、足量定量、足量 2、Ab限量限量 *AgAb 专用符号:专用符号:1、T 加入的加入的*Ag的放射性计数的放射性计数 2、B *AgAb免疫复合物的放射性计数免疫复合物的放射性计数 3、B0 Ag=0时时*AgAb放射性计数放射性计数 4、F 游离的游离的*Ag的的放射性计数放射性计数 T=B+F 5、NSB 非非特异性结合产生的放射性计数特异性结合产生的放射性计数 6、结合率:、结合率:B/T、B/B0、B/F竞争放射分析的三种基本试剂竞争放射分析的三种基本试剂
3、l标准品l标记物l特异性结合剂标标 准准 品品l化学结构化学结构:应与被测物具有相同的化学结构l化学纯度化学纯度:纯品l化学度量:化学度量:准确l稳定性:稳定性:保持生物活性不变标标 记记 物物l要求要求:1、较高的比活度 2、生物活性与免疫活性:与标记前一致 3、放射化学纯度:95%4、稳定性l鉴定:鉴定:1、最大结合率 2、标准曲线比较法 3、稀释曲线比较法特异性结合剂特异性结合剂l要求:要求:1、亲和力 2、高滴度 3、特异性 4、可长期保存抗抗 血血 清清l抗原l动物选择l佐剂l免疫动物、收获鉴定抗体抗抗血清的鉴定血清的鉴定l亲和力亲和力:指抗体与抗原的结合能力,常用平衡亲和常数指抗体
4、与抗原的结合能力,常用平衡亲和常数KA表示。表示。l特异性:特异性:抗体与相应抗原的结合能力与其它类似物结合能力的比较,常用抗体与相应抗原的结合能力与其它类似物结合能力的比较,常用 交叉反应率交叉反应率(Cross Reaction)表示表示 交叉反应率交叉反应率=Y/Z100%Y:标准抗原取代标准抗原取代50%结合率所对应的浓度结合率所对应的浓度 Z:类似物取代类似物取代50%结合率所对应的浓度结合率所对应的浓度 交叉反应率测定:以比正常生理浓度高交叉反应率测定:以比正常生理浓度高100倍以上的类似物为测定物进行测定,同倍以上的类似物为测定物进行测定,同时观察置换时观察置换0标准管标准管50
5、时所对应的化学量时所对应的化学量l滴度:滴度:结合结合50%标记抗原时血清的稀释度标记抗原时血清的稀释度单单 克克 隆隆 抗抗 体体l特点:特点:特异性高 抗体成分专一 可反复制备l制备:制备:1、免疫小鼠,制备脾细 胞悬液 2、选择培养,用HAT培 养基筛选杂交瘤细胞 3、检测抗体 4、克隆化其它特异性结合剂其它特异性结合剂l血浆结合球蛋白血浆结合球蛋白l受体蛋白受体蛋白放射性标记放射性标记T4与不同特异性结合剂与不同特异性结合剂结合与游离部分的分离l分离方法的要求分离方法的要求 1、使结合部分与游离部分尽可能完全 分开 2、分得的成分便于作放射性操作 3、分离效果不受外界干扰因素影响 4、
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