Marfey法和质谱联用技术-PPT.ppt
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1、Marfey法和质谱联用技术目目 录录前言前言LC/MS决定氨基酸绝对构型的原理决定氨基酸绝对构型的原理 1.Marfey 法分离机制的探讨法分离机制的探讨 2.Marfey法与质谱的联用法与质谱的联用 3.衍生化过程衍生化过程小小 结结应应 用用 举举 例例2前前 言言常见的确定化合物立体结构的方法有如下几常见的确定化合物立体结构的方法有如下几种:种:(1)化学转变法;)化学转变法;(2)旋光比较法;)旋光比较法;(3)旋光谱()旋光谱(ORD)和圆二色光谱()和圆二色光谱(CD););(4)单晶)单晶X射线衍射法;射线衍射法;(5)核磁共振法;)核磁共振法;(6)Marfey法与质谱联用。
2、法与质谱联用。3 目前酶法和目前酶法和CD法已用于决定氨基酸的绝对法已用于决定氨基酸的绝对构型,但这些都是直接的方法,构型,但这些都是直接的方法,确定一种对映确定一种对映异构体时需要相对大量的样品及较长的分析时间,异构体时需要相对大量的样品及较长的分析时间,因为在分析之前必须将每种氨基酸分离出来。因为在分析之前必须将每种氨基酸分离出来。另一方面,色谱方法例如另一方面,色谱方法例如GC和和HPLC已经已经代替这些直接方法广泛使用,氨基酸的绝对构型代替这些直接方法广泛使用,氨基酸的绝对构型是通过衍生化后,在非对映环境下比较对照品氨是通过衍生化后,在非对映环境下比较对照品氨基酸的保留时间来决定的,这
3、些色谱学方法的优基酸的保留时间来决定的,这些色谱学方法的优点在于分析所用的样品用量少、节省时间,并且点在于分析所用的样品用量少、节省时间,并且可以同时分析十种以上氨基酸。色谱学方法的缺可以同时分析十种以上氨基酸。色谱学方法的缺点在于需要对照品氨基酸,对于含有非常见氨基点在于需要对照品氨基酸,对于含有非常见氨基酸的肽类是不适用的。酸的肽类是不适用的。41984年,年,Marfey发明了一种用发明了一种用HPLC来决定氨基来决定氨基酸绝对构型的方法,该方法基于这样一个原理:酸绝对构型的方法,该方法基于这样一个原理:通过手性试剂进行衍生化,将通过手性试剂进行衍生化,将D-和和L-氨基酸用氨基酸用HP
4、LC分离成对映异构体。分离成对映异构体。于是引入手性试剂于是引入手性试剂FDAA(1-氟氟-2,4-二硝基二硝基苯基苯基-5)-L-丙氨酰胺,丙氨酰胺,(1-Fluoro-2,4-dinitrophenyl-5)-L-alaninamide ),被命名为),被命名为Marfey试剂。试剂。5氨基酸与氨基酸与Marfey试剂反应所得衍生物用常用的试剂反应所得衍生物用常用的HPLC进行分离,并在进行分离,并在UV340 nm处进行检测。处进行检测。L-氨基酸衍生物常常先于对应的氨基酸衍生物常常先于对应的D-氨基酸衍生物氨基酸衍生物从柱上洗脱下来,在梯度洗脱的条件下,该方法从柱上洗脱下来,在梯度洗脱
5、的条件下,该方法能正确地确定氨基酸的绝对构型,并且具有很高能正确地确定氨基酸的绝对构型,并且具有很高的灵敏度。的灵敏度。因此,因此,Marfey法广泛用于肽类化合物的结构确法广泛用于肽类化合物的结构确证,证实肽类合成中的外消旋作用。证,证实肽类合成中的外消旋作用。但是,在没有标准品的情况下,将该方法用来分但是,在没有标准品的情况下,将该方法用来分析含非常见氨基酸的肽类还是很困难的。析含非常见氨基酸的肽类还是很困难的。6大家应该也有点累了,稍作休息大家有疑问的,可以询问和交流大家有疑问的,可以询问和交流7常见的Marfey试剂如下所示:L-FDAA:(1-氟-2,4-二硝基苯基-5)-L-丙氨酰
6、胺 L-FDVA:.-L-缬氨酰胺 L-FDPA:.-L-苯丙氨酰胺 L-FDIA:.-L-异亮氨酰胺 L-FDLA:.-L-亮氨酰胺 D-FDAA:.-D-丙氨酰胺8其结构如下:9 为了将为了将Marfey法与质谱联用的方法建立起法与质谱联用的方法建立起来,必须解决如下三个问题:来,必须解决如下三个问题:(1)解释)解释Marfey法用作色谱技术的分离机制,法用作色谱技术的分离机制,及其局限。及其局限。(2)如何在没有标准品的情况下有效地将)如何在没有标准品的情况下有效地将Marfey法和质谱联系起来,来检测和确定目标法和质谱联系起来,来检测和确定目标氨基酸。氨基酸。(3)如何从一个肽类样品
7、的)如何从一个肽类样品的L-或或D-氨基酸中获氨基酸中获得相应的对映异构体得相应的对映异构体10LC/MS 决决 定定 氨氨 基基 酸酸绝绝 对对 构构 型型 的的 原原 理理Marfey 法分离机制的探讨法分离机制的探讨Marfey法与质谱的联用法与质谱的联用衍生化过程衍生化过程11Marfey 法分离机制的探讨法分离机制的探讨下图是用下图是用LC/MS来决定肽中氨基酸绝对构型的全来决定肽中氨基酸绝对构型的全过程,命名作过程,命名作“高级高级Marfey法法”12如图所示,肽水解所得氨基酸的混合物分成两部如图所示,肽水解所得氨基酸的混合物分成两部分(分(sample 1和和sample 2)
8、。Sample 1与与FDAA衍生化后,直接用衍生化后,直接用LC/MS分分析,通过衍生物的保留时间和质谱得以确定为何析,通过衍生物的保留时间和质谱得以确定为何种氨基酸,如果检测到有非常见氨基酸,其平面种氨基酸,如果检测到有非常见氨基酸,其平面结构可以通过其衍生物的质谱得以阐明。结构可以通过其衍生物的质谱得以阐明。Sample 2主要用来决定非常见氨基酸的绝对构主要用来决定非常见氨基酸的绝对构型。由于天然存在的肽类往往由型。由于天然存在的肽类往往由D-型或型或L-型氨基型氨基酸组成,在色谱图上,每个氨基酸给出一个峰,酸组成,在色谱图上,每个氨基酸给出一个峰,其绝对构型无法在这一步决定。因此,为
9、了得到其绝对构型无法在这一步决定。因此,为了得到其对映体,其对映体,Sample 2中的氨基酸必须在适当的中的氨基酸必须在适当的条件下进行外消旋化。但是,与条件下进行外消旋化。但是,与FDAA衍生化及衍生化及外消旋化后所得的色谱图变得复杂了,很难发现外消旋化后所得的色谱图变得复杂了,很难发现一对差向异构体。一对差向异构体。13在该法中使用了质量色谱。每对差向异构体有在该法中使用了质量色谱。每对差向异构体有两个峰,在以目标氨基酸衍生物分子离子碎片两个峰,在以目标氨基酸衍生物分子离子碎片的的m/z值为检测指标的质量色谱图上可以选择值为检测指标的质量色谱图上可以选择到这两个峰。到这两个峰。然后,通过
10、比较然后,通过比较Sample 1中原峰的保留时间和中原峰的保留时间和Sample 2中新产生峰的保留时间,就可以根据中新产生峰的保留时间,就可以根据Marfey法中的洗脱规律来判定绝对构型了。法中的洗脱规律来判定绝对构型了。14本法将可购得的氨基酸分为四类:中性本法将可购得的氨基酸分为四类:中性氨基酸、含氨基酸、含-OH和酸性氨基酸、碱性和和酸性氨基酸、碱性和N-甲基氨基酸,在同样的条件下研究其甲基氨基酸,在同样的条件下研究其分离行为。分离行为。FDAA主要与氨基酸上未取代的氨基、主要与氨基酸上未取代的氨基、酚羟基、巯基包括酚羟基、巯基包括N-甲基反应。甲基反应。15每种氨基酸的非对映每种氨
11、基酸的非对映异构体对都是通过其异构体对都是通过其D-异构体的保留时间异构体的保留时间(tRD)和和L-异构体的保异构体的保留时间留时间(tRL)的差值的差值(t)来判定的。当来判定的。当 t值大于值大于1.0时,每组时,每组非对映异构体对完全非对映异构体对完全被分离为两个非对映被分离为两个非对映异构体。异构体。左边的表格显示了四左边的表格显示了四种氨基酸的两种异构种氨基酸的两种异构体保留时间及其差异。体保留时间及其差异。16对中性氨基酸已经获得很好的判定,所有对中性氨基酸已经获得很好的判定,所有L-型非型非对映异构体都先于对映异构体都先于D-型被洗脱下来。随着烃基侧型被洗脱下来。随着烃基侧链增
12、长,判定效率提高,保留时间也会更长(亚链增长,判定效率提高,保留时间也会更长(亚氨基酸和脯氨酸除外)。酪氨酸得到两衍生物,氨基酸和脯氨酸除外)。酪氨酸得到两衍生物,因为因为FDAA会引入到会引入到NH2上,也会引入到酚上,也会引入到酚OH上。上。17酸性或含酸性或含OH氨基酸的判定相对于中性氨基氨基酸的判定相对于中性氨基酸要难一些。因为其保留时间变短。侧链含有酸要难一些。因为其保留时间变短。侧链含有酰氨基的天冬酰胺、谷氨酰胺比天冬氨酸和谷酰氨基的天冬酰胺、谷氨酰胺比天冬氨酸和谷氨酸更难判定。在含氨酸更难判定。在含OH的氨基酸中,丝氨的氨基酸中,丝氨酸显示出最差的判定能力,但是高丝氨酸的判酸显示
13、出最差的判定能力,但是高丝氨酸的判定稍好些,氧甲基丝氨酸显示了与丙氨酸相似定稍好些,氧甲基丝氨酸显示了与丙氨酸相似的判定能力。另外,的判定能力。另外,-OH天冬氨酸的两个非天冬氨酸的两个非对映异构体显示相反的洗脱规律,而且它们的对映异构体显示相反的洗脱规律,而且它们的保留时间极短保留时间极短18对于碱性氨基酸,赖氨酸和鸟氨酸有三种衍生对于碱性氨基酸,赖氨酸和鸟氨酸有三种衍生物:单物:单-取代、单取代、单-取代和二取代衍生物;取代和二取代衍生物;组氨酸有两种衍生物,单组氨酸有两种衍生物,单-取代和双取代衍生取代和双取代衍生物。它们的单物。它们的单-取代和双取代可被判定,而单取代和双取代可被判定,
14、而单-取代衍生物无法判定,表明取代衍生物无法判定,表明-氨基的衍生氨基的衍生化对于判定是必要的。化对于判定是必要的。19但是碱性氨基酸的洗脱规律取决于所选流动相但是碱性氨基酸的洗脱规律取决于所选流动相的的PH大小,可能为大小,可能为L D的常规顺序,也可的常规顺序,也可能相反。赖氨酸和组氨酸的双衍生物显示了正能相反。赖氨酸和组氨酸的双衍生物显示了正常的洗脱规律,而鸟氨酸却显示相反的顺序,常的洗脱规律,而鸟氨酸却显示相反的顺序,尽管它们有较长的保留时间。尽管它们有较长的保留时间。20购得的购得的N-甲基氨基酸,例如丙氨酸、苯丙氨酸、甲基氨基酸,例如丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和天冬氨酸的缬氨
15、酸、亮氨酸和天冬氨酸的N-甲基衍生物,甲基衍生物,尽管其保留时间长于各母氨基酸,但其判定能尽管其保留时间长于各母氨基酸,但其判定能力要低于母氨基酸。尤其是力要低于母氨基酸。尤其是N-甲基丙氨酸无法甲基丙氨酸无法判定,判定,N-甲基天冬氨酸以相反顺序被洗脱出。甲基天冬氨酸以相反顺序被洗脱出。21综上,综上,FDAA的的L-氨基酸衍生物并不总是氨基酸衍生物并不总是先于对应的先于对应的D-氨基酸衍生物被洗脱下来。氨基酸衍生物被洗脱下来。因此,阐明不了分离机制,因此,阐明不了分离机制,Marfey 法就法就不能用于非常见氨基酸的判定。不能用于非常见氨基酸的判定。此外,实验结果表明以下两点对于洗脱此外,
16、实验结果表明以下两点对于洗脱顺序至关重要:顺序至关重要:氨基酸的疏水性;氨基酸的疏水性;在分离过程中在分离过程中FDAA衍生物的构象。衍生物的构象。22使用使用UV(二极管阵列检测器)和(二极管阵列检测器)和NMR方法来方法来解决该问题(因为,它们易受构象的影响)解决该问题(因为,它们易受构象的影响)。23如上图所示,在如上图所示,在340和和414nm处有特征性最大处有特征性最大吸收,是由二硝基苯上的硝基与氨基酸及吸收,是由二硝基苯上的硝基与氨基酸及L-丙氨酰胺的丙氨酰胺的NH2之间的氢键所形成的发色团之间的氢键所形成的发色团产生的;而且,产生的;而且,D-缬氨酸衍生物的缬氨酸衍生物的UV谱
17、与其谱与其L-型衍生物的相符。所有被测氨基酸的衍生型衍生物的相符。所有被测氨基酸的衍生物显示非常相似的物显示非常相似的UV谱,脯氨酸和谱,脯氨酸和N-甲基氨甲基氨基酸除外。尤其是给出相反洗脱顺序的双取基酸除外。尤其是给出相反洗脱顺序的双取代衍生物及代衍生物及D-和和L-鸟氨酸显示了特征的鸟氨酸显示了特征的UV谱,谱,其吸收波长从其吸收波长从340nm蓝移到蓝移到320nm。24这些结果表明,稳定的构象,包括分子内氢这些结果表明,稳定的构象,包括分子内氢键,形成了一个像蒽一样的三环系统的平面键,形成了一个像蒽一样的三环系统的平面分子(如下图所示)。分子(如下图所示)。25综上,对于综上,对于L-
18、和和D-氨基酸衍生物的判定基于其氨基酸衍生物的判定基于其疏水性的差异,源于氨基酸和疏水性的差异,源于氨基酸和L-丙氨酰胺丙氨酰胺碳上两个疏水性取代基的顺反位置。于是,碳上两个疏水性取代基的顺反位置。于是,顺式排列的顺式排列的FDAA衍生物与衍生物与ODS作用更强烈,作用更强烈,比反式排列的衍生物有更长的保留时间。比反式排列的衍生物有更长的保留时间。对于大多数氨基酸来说,由于氨基酸侧链取代对于大多数氨基酸来说,由于氨基酸侧链取代基的疏水性往往小于基的疏水性往往小于COOH,D-氨基酸衍生氨基酸衍生物具有顺式结构,因此在物具有顺式结构,因此在Marfey 法中法中L-氨基酸氨基酸衍生物往往先于衍生
19、物往往先于D-氨基酸衍生物出柱。氨基酸衍生物出柱。另有文献证明,氢键的形成对结构的判定也是另有文献证明,氢键的形成对结构的判定也是很有用的。很有用的。26L-缬氨酸的缬氨酸的FDAA衍生物的衍生物的NOE实验显示,缬实验显示,缬氨酸的氨酸的-质子及质子及L-丙氨酰胺的丙氨酰胺的-质子与苯环的质子与苯环的H6之间存在着强烈的之间存在着强烈的NOE,如上图所示;,如上图所示;而而H6与缬氨酸的异丙基和与缬氨酸的异丙基和L-丙氨酰胺的甲基丙氨酰胺的甲基之间没有之间没有NOE。另外,。另外,D-缬氨酸的缬氨酸的FDAA衍生衍生物与物与L-衍生物几乎显示相同的衍生物几乎显示相同的NMR行为。这些行为。这
20、些结果表明,两结果表明,两-质子都在空间上位于苯环质子都在空间上位于苯环H6的附近,在的附近,在L-和和D-缬氨酸衍生物中均如此。缬氨酸衍生物中均如此。由此,缬氨酸和丙氨酰胺的除由此,缬氨酸和丙氨酰胺的除NH2以外的其以外的其它取代基均位于垂直于二硝基苯平面的位置上,它取代基均位于垂直于二硝基苯平面的位置上,在溶液中是稳定的,也是占优势的。在溶液中是稳定的,也是占优势的。27如图所示:如图所示:D-缬氨酸的缬氨酸的FDAA衍生物为顺衍生物为顺(Z)式排列,两个疏水性取代基在同侧;)式排列,两个疏水性取代基在同侧;L-缬氨酸的缬氨酸的FDAA衍生物为反(衍生物为反(E)式排列,)式排列,两个疏水
21、性基团在异侧。两个疏水性基团在异侧。28为了确定为了确定COOH是否对结构的判定必不可少,是否对结构的判定必不可少,文章对氨基酸甲酯和脱文章对氨基酸甲酯和脱COOH的氨基化合物的氨基化合物的的FDAA衍生物进行了研究。衍生物进行了研究。29所测氨基酸甲酯及氨基化合物的判定结果如上所测氨基酸甲酯及氨基化合物的判定结果如上表所示,它们的表所示,它们的UV谱与母氨基酸的完全相同,谱与母氨基酸的完全相同,保留时间比母氨基酸长,氨基酸甲酯的判定能保留时间比母氨基酸长,氨基酸甲酯的判定能力下降。力下降。另外,丙氨酸甲酯的另外,丙氨酸甲酯的FDAA衍生物未得判定,衍生物未得判定,丝氨酸甲酯衍生物显示相反的洗
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