DB21∕T 3493—2021 牛体外受精胚胎生产及非手术法移植技术操作规程(辽宁省).pdf
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1、TCS 65. 020. 30 CCS 843 四日21辽r-l-, 丁-省山巳ET圃,万标准DB21/T 3493一-2021牛体外受精胚胎生产及非手术法移植技术操作规程2021-08-30发布2021-09-30实施辽宁省市场监督管理局发布DB21/T 3493-2021 目IJ1=1 本文件按照GB/T1.1-2020 标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由辽宁省农业农村厅提出并归口O起草单位:辽宁省农业发展服务中心、辽宁省牧经种牛繁育中心有限公司。主要起草人:李宁、刘海军、刘全、黄
2、承俊、杜学海、李傲楠、张文军、张丽君、赵刚、周成利、唐学戚、安辉。本文件发布实施后,任何单位和个人如有问题和意见建议,均可以通过来电和来函等方式进行反馈我们将及时答复并认真处理,根据实际情况依法进行评估及复审。归口管理部门通讯地出辽宁省农业农村厅ci尤阳市和平区太原北街2号),联系电话:024-23447862 起草单位通讯地址辽宁省农业发展服务中心(沈阳市皇姑区辽河街60号L联系电话024-81845035DB21/T 3493-2021 牛体外受精胚胎生产及非手术法移植技术操作规程1 范围本文件规定了牛体外胚胎生产的卵母细胞采集、体外成熟、体外受精、体外培养、胚胎质量鉴定、胚胎冷冻、胚胎解
3、j宋平日胚胎移植的技术要求。本文件适用于牛体外胚胎生产及移植的技术操作。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性寻|用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件:不住日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB 4143 牛冷冻精液GB!T 5458 液氮生物容器GB!T 25881 牛胚胎NY!T 1572 牛胚胎移植技术规程DB21/T 1648 牛胚胎移植技术操作规程3 术语和定义没有需要界定的术语和定义。4 仪器与溶液4.1 仪器设备4. 1. 1 二氧化碳培养箱使用前在38.5 oc、5%C02、饱和温度条件下平衡
4、24h以上。4.1.2 超净台使用前20min,打开风机和紫外线灯对操作台面和在超净台:-p使用怕器材进行表面灭菌,液体操作时应点燃酒精灯。4.1.3 恒温加热板,水浴锅恒温加热板、水浴锅的使用温度为37oc,水浴锅中液体为蒸馆水。4.1.4 液氮罐液氮含量不得低于容积的1/3。4. 2 溶液4.2.1 常用溶液DB21/T 3493-2021 抗菌生理盐水(含青霉素和链霉素各0.075g/L)、采卵液、成熟液(M199)、精子洗涤液、受精液(80液)、胚胎培养液(CR1aa)、胚胎冷冻液、胚胎解冻液。4. 2. 2 溶液配方溶液的配方见附录A。4. 2. 3 溶液的制备4.2.3.1 基础溶
5、液配制按所配制溶液的配方称量药品,然后用超纯水运一进行溶解。配制完成后调节pH1与渗透压,用0.22J.lm孔径滤膜除菌,在无菌环境下装瓶封口备用。各类溶液应按要求存放及保存,不应使用变质或过期的溶液。4. 2. 3. 2 成品溶液配制根据要求或试验设计,称量好所有药品后用基础溶液进行一次性溶解,然后用o.22m孔径滤膜除菌备用。不用添加任何药品的成品溶液可直接使用。5 卵母细胞的采集5. 1 活体采卵5. 1. 1 供体牛的选择卵巢发育良好的空怀经产母牛。5.1.2 1:共体牛的饲养管理供体牛应摄入足够的优质干草、青贮或多汁饲料、精料以及清洁的饮水,保证日粮营养全面、均衡。5.1.3 采卵频
6、率两个月采卵一次。采卵前4片h肌注FSH进行卵泡的诱导发育。5.1.4 采卵方法于尾椎和荐椎结合处或第一与第二尾椎结合处注射2.5mL 5%盐酸利多卡因进行硬膜外腔麻醉。将带有超声波探头和采卵针(18G或21G的一次性短计头)的采卵器插入到阴道穹隆处,通过直肠把握法将卵巢贴在探头上,在40mmHg (18G)或120mmHg (21G)负压下,根据B超屏幕上所显示的卵泡位置进行穿刺。穿刺卵泡的表面直径为2mm8 mmo每头牛应单独采集,并标注好信息。采集后用采卵液洗管3次,将收集的液体在37C环境下,于4h内运回实验室。所用采卵液自己方见附录A中A.lo5. 2 离体采卵5.2.1 卵巢的摘取
7、牛屠宰后30min内摘取卵巢,置于盛37oC抗菌生理盐水的保温杯中,在4h内运团实验室。如果时间超过4h,可在4C低温保存环境中运团实验室。5.2.2 卵母细胞的采集2 DB21/T 3493-2021 去除卵巢周围多余的组织,用37oc的抗菌生理盐水洗涤5次6次。将洗涤好的卵巢与抗菌生理盐水一起置于37oc的恒温加热板上备用。采卵时,用消毒的纱布包裹住卵巢,用配有18号针头的10mL 注射器从侧面穿刺,吸取表面直径2mm8 mm泡内的液体。可一次性将所有卵巢的卵泡液抽出,集中捡卵:也可以每5个6个卵巢捡卵一次。6 卵母细胞的体外成熟。1成熟液的预平衡取卵前2h,制备好成熟盘与洗涤盘(1mL2
8、 mL成熟液/次),于二氧化碳培养箱中预平衡,成熟液配方见附录A中A.206. 2 卵母细胞的挑选在室温下,选择形态正常、胞质均匀、周围带有致密卵丘细胞的卵丘卵母细胞复合体,在成熟液中洗涤3次5次,备用。6. 3 卵母细胞的培养在室温下,将洗涤好的卵丘卵母细胞复合体置于预平衡的成熟液中,密度为1枚/2.5L或50枚/mL100枚/mL.在二氧化碳培养箱中培养20h24 h。7 卵母细胞的体外受精7. 1 受精用液的预平衡体外受精前2h,制备好受精微滴(50L/滴,石蜡油覆盖)、精子洗涤液(6mL)、受精液(8mL)、卵子洗涤盘(1mL2 mL受精液/次),于二氧化碳培养箱中预平衡。精子洗涤液配
9、方见附录A中A.3 7. 2 精子的体外获能冷冻精液质量应符合GB41,1c3的规定。将细管冻精在37oc水中解冻10s,检查活力与密度后,把精液置于桔子洗涤液中,以450倾斜方式在二氧化碳培养箱中孵浴1ho 7. 3 卵母细胞的处理将体外培养20h24 h的卵母细胞在受拮液中洗澡3次5次,洗涤过程中用100旺的移液检微量去除卵丘细胞,然后移入受精微滴中,10枚/滴20枚/滴。7.4 精液的制备孵浴后的桔子取上1/32/3液体,在2000r/min下离心7min,弃去上请液,再用受精液洗涤一次,然后用受精液调试密度为1x10b6x106个/mL.置于二氧化碳培养箱中备用。7. 5 体外受精将制
10、备好的精液用100L移液枪移入含有卵母细胞的微滴中(50L/滴),于二氧化碳培养箱中培养6h8 h。8 受精卵体外培养3 DB21/T 3493-2021 8. 1培养液的预平衡培养前2h,制备好培养微滴000L/滴,石蜡油覆盖)和洗涤盘omL 2 mL培养液/次)于二氧化碳培养箱中预平衡。胚胎培养液配方见附录A中A.508. 2体外培养将体外受精6h8h后的假设合子置于培养液中洗涤3次5次,洗涤过程中用100L移液枪或吸卵管吹打假设合子,去除周围残留的卵丘细胞和精子。将洗涤后的假设合于移入培养微滴中,10枚/滴,置于二氧化碳培养箱中继续培养6天8天,中途可换液二次,也可不换,发育到桑囊胚阶段
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