SN∕T 1632.4-2022 出口乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检测方法 第4部分:PCR-CRISPR法.pdf
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1、I C S6 7. 0 5 0C C SX1 6中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T1 6 3 2. 42 0 2 2 出口乳粉中克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌)检测方法 第4部分:P C R - C R I S P R 法T e s t m e t h o d o f C r o n o b a c t e r s p p.(E n t e r o b a c t e r s a k a z a k i i)i n e x p o r t m i l k p o w d e rP a r t 4:P C R - C R I S P R m e t h o d2 0 2 2 - 0 3
2、- 1 4发布2 0 2 2 - 1 0 - 0 1实施中华人民共和国海关总署发 布前 言 本文件按照G B/T 1. 12 0 2 0和G B/T 2 0 0 0 1. 42 0 1 5的规定起草。本文件是S N/T 1 6 3 2 出口乳粉中克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌) 检测方法 的第4部分。S N/T 1 6 3 2已经发布了以下部分: 第1部分: 分离与计数; 第2部分:P C R方法; 第3部分: 荧光P C R方法; 第4部分:P C R - C R I S P R法。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并
3、归口。 本文件起草单位: 中华人民共和国上海海关、 上海市质量监督检验技术研究院、 深圳大学第一附属医院、 大连民族大学。 本文件主要起草人: 杨捷琳、 刘洋、 张清平、 薛俊欣、 杨娟、 张懿翔、 袁辰刚、 李林显、 蒋原、 王金、郭德华、 王越、 申进玲、 曲勤凤、 郑秋月、 张奕南、 赵磊。S N/T1 6 3 2. 42 0 2 2出口乳粉中克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌)检测方法 第4部分:P C R - C R I S P R法1 范围本文件规定了乳粉中克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌) (C r o n o b a c t e r s p p.) 的P C R - C R I S P R检
4、测方法。本文件适用于乳粉中克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌) (C r o n o b a c t e r s p p.) 的定性检测。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中, 注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件; 不注日期的引用文件, 其最新版本( 包括所有的修改单) 适用于本文件。G B 4 7 8 9. 4 0 食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌) 检验G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法G B/T 2 7 4 0 32 0 0 8 实验室质量控制规范食品分子生物学检测3 术语、 定
5、义和缩略语3. 1 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1. 1 C a s蛋白 C a s p r o t e i nC a s蛋白是指C R I S P R - a s s o c i a t e d蛋白, 它是C R I S P R系统中起功能作用的相关蛋白。3. 1. 2C a s 1 2 b酶 C a s 1 2 b e n z y m eC a s蛋白的一种, 属于I I类V - b型C a s蛋白, 是c r R NA:t r a c r R NA(s g R NA) 依赖的核酸内切酶。3. 1. 3向导R N A g u i d e R N A向导R NA是指引导C a
6、 s蛋白特异性结合靶标D NA序列的R NA, 通常由c r R NA或c r R NA:t r a c r R NA(s g R NA) 复合物组成。3. 1. 4N值 N v a l u eC R I S P R方法检测结果的判定值。3. 2 缩略语下列缩略语适用于本文件。C R I S P R: 成簇的规律间隔的短回文重复序列(c l u s t e r e d r e g u l a r l y i n t e r s p a c e d s h o r t p a l i n d r o m i c r e -p e a t s) t r a c r R NA: 反式激活C R I
7、S P R R NA(t r a n s - a c t i v a t i o n C R I S P R R NA)1S N/T1 6 3 2. 42 0 2 24 方法提要本文件通过P C R - C R I S P R方法对乳粉中克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌) 开展定性检测。首先采用普通P C R进行克罗诺杆菌属f u sA基因特异性扩增, 再用C R I S P R反应特异性切割扩增产物, 观察荧光值增量并给出结果判定。C R I S P R/C a s 1 2 b是基因编辑系统中的一种, 其对应的t r a c r R NA和c r R NA通过碱基互补配对方式形成R NA复合结构,
8、 该结构与C a s 1 2 b结合形成复合物, 如果有目标D NA存在,C a s 1 2 b蛋白在c r R NA:t r a c r R NA引导下特异性结合靶标核酸, 之后其非特异性切割单链D NA的活性被激活, 从而将体系中单链D NA报告分子切开并释放出可检测的信号。5 试剂和材料除另有规定外, 所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合G B/T 6 6 8 2一级水的要求。所有试剂均用无D NA/R NA酶污染的容器分装。5. 1 缓冲蛋白胨水(B PW) 。5. 2 裂解液:2 0 g/L C TA B,1. 4 m o l/L N a C l,0. 1 m o l/L T
9、r i s - HC l,0. 0 2 m o l/L E D TA,p H调至8. 0。5. 3 T E缓冲液:1 mm o l/L T r i s - HC l,0. 1 mm o l/L E D TA,p H 8. 0。5. 4 蛋白酶K:2 0 m g/mL。5. 5 T r i s饱和酚。5. 6 三氯甲烷。5. 7 异戊醇。5. 8 乙醇。5. 9 2P C R缓冲液:P h a n t a M a x B u f f e r。5. 1 0 d NT P 混合液 (1 0 mM) 。5. 1 1 D NA 聚合酶。5. 1 2 N E B u f f e r:1 0 0 mM N
10、a C I,5 0 mM T r i s - HC I,1 0 mM M g C l2,1 0 0 u g/m l B S A,p H 7. 9。5. 1 3 R NA酶抑制剂。5. 1 4 T a q M a n实时荧光P C R预混液:T a q D NA 聚合酶、P C R反应缓冲液、 氯化镁、d NT P s( 含d AT P、d UT P、d C T P、d G T P) ) 和UNG酶按比例配制的溶液。5. 1 5 检测用引物和探针P C R扩增及C R I S P R反应所用引物、c r R NA和探针序列详见表1。表1 克罗诺杆菌属引物、c r R N A与探针引物/探针序列(
11、53 )靶基因碱基数(b p)引物F5AA C A C G C T T T C TAA C G T T GA TAAG G 3引物R5C T T T T G T C G TAAGAG C AGAG G T GAG 3c r R NA5C GAG C GAU C UGAGAAGUG G C A C AUAAG G C C AAUAAUAAUG 3f u s Aa2 52 54 0C a s 1 2 b -t r a c r R NA5GU C UAGAG GA C AGAAUUUUU C AA C G G GUGUG C C AAUG G C C A CUUU C C AG GUG G C AA
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