T∕CVMA 93-2022 猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲型)时间分辨荧光免疫层析抗体检测方法.pdf
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1、ICS 11.220B 41团体标准T/CVMA 932022猪繁殖与呼吸综合征病毒 (美洲型) 时间分辨荧光免疫层析抗体检测方法TRFIA for detection of antibodies Porcin Reproductive and RespriratorySyndrome Virus of American Type2022 - 08 - 12 发布2022 - 08 - 12 实施中国兽医协会发 布T/CVMA 932022I前言本文件按照 GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第 1 部分标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发
2、布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由洛阳现代生物技术研究院有限公司提出。本文件由中国兽医协会归口。本文件起草单位:洛阳现代生物技术研究院有限公司、中国科学院微生物研究所、河南省动物疫病预防控制中心、洛阳莱普生信息科技有限公司、湖州市动物疫病预防控制中心。本文件主要起草人:郎洪武、谢彩华、杨利敏、刘文军、程果、马震原、原小燕、耿玉静、刘影、李玉婉、王华俊、刘慧芳、郭育培、王翠。T/CVMA 9320221猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲型)时间分辨荧光免疫层析抗体检测方法1范围本文件规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒 (美洲型) 抗体荧光层析检测方法、 试剂与耗材、 技术原理、实验前准备工作、操作步骤
3、、结果计算、实验成立条件及结果判定等内容。本文件适用于检测猪全血或血清中的猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲型)抗体,并可用于猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲型)抗体的免疫筛查、辅助诊断等。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中, 注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。NY/T 541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1时间分辨荧光免疫层析技术 Time Resolved Fluorescence Immunochromatograp
4、hy assay (TRFIA)是以时间分辨荧光微球作为示踪物, 将抗原抗体固定在硝酸纤维素膜上, 通过层析来呈现免疫反应结果的一种新型免疫分析技术。4试剂与耗材4.1猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲型)抗体荧光微球检测卡的制备,按照附录 A 制备。4.2相关试剂配制,按照附录 B 制备。4.3微量毛细采样管(10 L)。4.4移液枪(10 L100 L)。4.5便携式免疫荧光分析仪及配套 ID 卡,能在荧光检测波段 365/610 nm 条件下检测,按照附录 C 操作。4.6注射器(5 mL)。T/CVMA 93202225技术原理本检测试纸采用时间分辨荧光免疫层析方法和间接法试验原理, 检测猪
5、繁殖与呼吸综合征病毒 (美洲型) 抗体。 通过样本与荧光微球标记物沿层析膜移动, 样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体 (美洲型)与荧光微球标记物、检测线(T线)上的抗原结合而产生荧光信号值(T值),荧光微球标记物继续移动与质控线(C线)上的抗体结合产生荧光信号值(C值),仪器计算出T/C值即为PPRV抗体检测值。若样本中不存在猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲型)抗体,则检测线不产生荧光信号。6实验前准备工作6.1样本采集及处理按照NY/T 541中规定进行样本的采集与处理,并做好个人防护。按常规方法抽取2 mL3 mL血液置洁净干燥的试管中,静置约1 h待血液凝固后于4000 r/min离心10 m
6、in(也可将血液样本静置约2 h,待血液凝固自然析出血清),分离血清。要求血清清亮,无溶血、无污染。若无上述条件分离血清, 可直接用全血检测。 全血样品容器中应加入下列抗凝剂中的任意一种: 0.1%肝素钠、阿氏液、3.8%4.0%枸橼酸钠(0.1 mL可抗1 mL血液)、乙二胺四乙酸(EDTA)等抗凝剂,采血后充分混合。6.2血清样本的存放与运输按照NY/T 541中规定进行血清样本的存放与运输。血清样本若在一周内检测,可置2 8 条件下保存。若超过一周检测,应置于-20 以下冷冻保存。运输时注意冷藏,确保样品清亮无污染。采集的血清样本可用冰袋或保温桶加冰密封等方式运输, 运输时间应尽量缩短。
7、 按照相关规范进行样品的生物安全标识。6.3全血样本的存放与运输按照NY/T 541中规定进行全样本的存放与运输。 全血样本若在24 h内检测, 应置于4 条件下保存;若超过24 h检测, 应置于-20 以下冷冻保存。 采集的全血样本可用冰袋或保温桶加冰密封等方式运输,运输时间应尽量缩短。按照相关规范进行样品的生物安全标识。7操作步骤7.1样品稀释将微量毛细采样管取10 L全血或血清样本加入到已备好的样本稀释液中混匀, 稀释后的样品应在1 h内完成检测。可按照以下两种方式稀释:a)离心管稀释,将检测样本在 1.5 mL 离心管中做 10 倍稀释并混匀。b) 稀释板稀释,将检测样本在稀释板上做
8、10 倍稀释并混匀。7.2取检测卡将恢复至室温的试纸卡从铝箔包装中取出,将检测卡放于平整、洁净的台面上。T/CVMA 93202237.3加样及孵育用配套吸管吸取待检样本,垂直而缓慢地滴加2 3 滴(约80 L)到加样孔内,室温下放置10min15 min。7.4仪器检测值读数前先将产品配套ID卡插入便携式荧光免疫分析仪, 之后将反应到时间的检测试纸加样孔朝里插入便携式荧光免疫分析仪,点击“快速检测”进行读数,超过25 min的结果无效。8结果计算便携式荧光免疫分析仪通过365/610 nm光波激发和收集检测线(T线)和质控线(C线)上的荧光信号,仪器将荧光信号值转换成数值(T值和C值),T/
9、C值即为样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲型)抗体检测值(软件自带计算功能,能准确计算出T/C值)。9实验成立条件当仪器完成读值后,如果“检测值”项显示“无效”,说明仪器未检测到荧光信号,则实验不成立,需重新检测。如果“检测值”项显示数值,说明质控线和检测线荧光信号值正常,则实验成立。10结果判定标准当PRRS检测值0.1时,为猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲型)抗体阴性。当PRRS检测值0.1时,为猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲型)抗体阳性。T/CVMA 9320224附录A(规范性)猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲型)抗体荧光微球检测卡的制备A.1重组猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲型)NSP7 蛋白的
10、制备A.1.1菌液繁殖用接种环挑取-70 保存的基础种子批 (P5) E.coli-NSP7菌株划线于含30 g/mL卡那霉素抗性的LB固体培养基,37 2 温箱倒置培养12 h16 h。挑取单菌落接种于少量LB液体培养基(含30 g/mL卡那霉素),在37 2 条件下、以200 r/min振荡培养8 h12 h。A.1.2重组NSP7蛋白的诱导表达将菌液以1%的接种量转接至LB液体培养基(含30 g/mL卡那霉素),在37 2 条件下,以200 r/min振荡培养至OD600 nm值达到0.6时,加入终浓度为0.2 mmol/L的IPTG,在37 2 条件下,以200 r/min继续振荡培养
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