DB62∕T 4094-2020 草品种真实性检验规程 SSR 标记法(甘肃省).pdf
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1、ICS 65. 120 B 25 甘肃省地DB62 万析、准DB 62fT 4094-2020 草品种真实性检验规程SSR标记法Rules for variety genuineness testing ofherbaceous plant SSR marker method 2020一03-16发布2020一04一01实施甘肃省市场监督管理局发布0862月4094-2020目;欠前言II I 范围. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2、 . . . . . . . . . . . . . 1 2 规范性引用文件- . . . . . . . 1 3 术语和定义1 4 原理. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 试验样品- . . . 2 6 仪器设备及试剂. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 熔液配制2 B 引物信息. . . . . . .
3、. . . . . 2 9 操作程序2 10 数据记录与统计. 4 11 结果判定方法. 4 附录A(规范性附录)主要仪器设备及试剂. . . . . . . 5 附录B(规范性附录)珞液配制7 附录c(规范性附录)引物信息. 9 附录D(资料性附录)参照品种信息. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 附录E(规范性附录)凝胶配制14 附录F(资料性附录)SSR标记电泳图谱. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4、 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 附录G(规范性附录)数据统计记录表. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 I 0862/T 4094-2020 目IJ1=1 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由甘肃省林业和草原局提出并负责监督实施。本标准由甘肃省草业标准化技术委员会归口。本标准起草单位兰州大学草地农业科技学院,农业农村部牧草与草坪草种子质量监督检验测试中心(兰州1),全国畜牧总站,
5、甘肃省草原技术推广总站。本标准主要起草人:文Ij文献,谢文刚,闵学阳,齐晓,邵麟惠,陈志、宏,向金城。II 0862月4094-2020草品种真实性检验规程SSR标记法1 范围本标准规定了利用SSRCSimpleL)、杂花茵蓓CMedicago及结果判定方法。本标准适用于2 规范性引用文件3 3. 1 3.2 参照品种代表核d心位异扩增片段的大小,3.3 DNA分子标记个体问遗传物质核背3.4 SSR分子标记simple 基因组中由l4 原理rI重复)标记进行紫花茵蓓CMedicagosativa L)品种鉴定的试验分析、数据采集的版本适用于本文件。SSR位点上等位变SSR广泛分布于植物基因组
6、的不同位置,且因不同品种问单个SSR位点重复单位数量的不同而存在多态性,是种应用广泛的DNA分子标记。这种多态性序列两侧的序列高度保守且为单拷贝,可根据其序列设计一对特异引物,通过PCR扩增检测不同样品DNA间的特异片段。因此,根据比较送检样品与比对样品的特异片段可对紫花茵宿、杂花茵蓓及箭警豌豆品种进行鉴定。1 0862/T 4094-2020 5试验样品5. 1 样品种类送检样品为种子或叶片组织。5. 2 样品的要求供试样品由委托检验的单位、组织或个人提供,包括送检样品和比对样品。比对样品为己通过审定的品种时,其样品由政府相关管理部门或该部门指定机构提供。比对样品为委托人提供的品种时,检测结
7、果仅表示送检样品与比对样品是否为同品种,不提供品种真实性判断。送检样品种子数至少2000粒且发芽率不低于80%。随机选取200粒300粒送检样品种子,按照GB/T 2930.4规定的纸上发芽床方法进行萌发。种子萌发10天后,等量采取40个茵蓓单株或10个箭警豌豆单株叶组织进行混合(10g2.0g)。当送检样品为生长在大田的叶片组织时,可由抨样员到田间取样。取样的地块白委托检验的单位、组织或个人指定,采用棋盘式取样法,等量采取40个茵蓓单株或10个箭警豌豆单株叶组织进行混合(.Og2.0g),保存于硅胶干燥器或液氮中。每个品种采取2份混合样品。6仪器设备及试剂仪器设备及试剂见附录A。7 溶液配制
8、i自液配制方法见附录B,所用试剂均为分析纯。8 号|物信息引物信息表见附录C。9 操作程序9.1 DNA提取混合叶组织在液氮中充分研磨后移入2.0mL离心管中。每管加入700LDNA buffer自液,混合均匀,65 C水浴10min,期间颠倒混匀23次;冷却至室温,加195L5MKAc,冰上放置5min。在jJl风橱内加入600L24:1氯仿-异戊醇(VV),颠倒混匀,12000 r/min,室温离心lOmin,吸取上清液至新的离心管。在上清液中加入36L3MNaAc和240L异丙醇,混合均匀,室温放置10min, 12000 r/min 离心10min,弃上清液;加入500L75%乙醇,将
9、沉淀弹起,离心2min,但j出乙醇;接着12000r/min 离心30s40 s,并用10L移液检将残液吸出。通风橱中将残留的乙醇挥发彻底,之后加入20LddH20i自解混匀。用Nanodrop分光光度i十测定DNA浓度和质量(OD260/0D280巳18),吸取部分原液稀释成50ng/,L的工作液,4C保存。参照品种(附录D)的取样与DNA提取与送检样品同样方法处理。9.2 PCR扩增9.2. 1 反应体系2 0862月4094-2020PCR反应体系为101L,在PTC-200热循环仪上进行:模板DNA1L (50 ng/,L), PCR Mix 5L, Tap酶0.1L,正反向引物各lL
10、(10mol/L),其余用ddH20补足至终体积。如果PCR过程中不采用热盖程序,则反应液上覆盖151L矿物油。9.2.2 反应程序94 -C预变性3min; 94 -C变性30s, 56-C或57-C退火30s,72-C延伸45s, 3035个循环数72-C 延伸7min;4 -C保存。每对引物重复2次PCR反应。9.3 PCR 9.3. 1青洗玻璃板将玻璃板清洗干净,两块玻璃板互相污染。9.3.3串IJ胶在100mL i窑液1.0mL ( 上部轻轻插干净备用。9.3.4 将其超出用9.3.6 银染银染的操作过程具体如下:纸擦干。操作过程中防止的10%过硫酸绞璃板夹层,在梳子,用水清洗XTB
11、E缓冲液,使。每一个加样孔点下电泳,电泳l.5h璃板,从玻璃板上取下凝a) 固定:将凝胶置于固定液中,附着凝胶面朝上,使固定液没过凝胶,在摇床上轻轻晃动20mm30mm; b) 漂i先取出凝胶,在蒸恼水中漂洗l次2次,c) 染色将凝胶置于染色液中,使染色液没过凝胶,在摇床上轻轻晃动10min15 min; d) 漂洗:取出凝胶,在蒸馆水中漂洗l次,不超过10S; e) 显影将凝胶置于显影液中,使显影液没过凝胶,轻轻晃动至出现清晰带纹,f) 定影将凝胶置于固定液中,使固定液没过凝胶,定景5 min; g) 漂洗:取出凝胶,在去离子水中漂洗1min。3 0862/T 4094-2020 9. 3.
12、 7 拍照凝胶拍照结果模式参见附录F。10 数据记录与统计以1,。形式代表同一分子量大小条带的有无,记录送检样品和比对样品在所有位点的DNA电泳谱带数据,按照附录G统计送检样品和比对样品的差异位点,差异等位变异数,并统计相似度。11 结果判定方法首先根据附录C中前半数引物的扩增结果,对送检样品和比对样品的相似度进行比较。当样品问相似度小于等于90%时,则认定为不同品种当样品问相似度大于90%时,继续利用附录C中剩余的引物进行扩增检测,最终根据相似度值判定为不同品种、近似品种或者疑同品种。具体判定方法如下a) 比对结果相似度S三90%,判定为不同品种b) 比对结果相似度90%S100%,判定为近
13、似品种c) 比对结果相似度S二100%,判定为疑同品种。品种相似度S按照()进行计算。s=了?二生x100 - Nt+Nj ) l ( 式中S 相似度,%; NiJ 品种1和J之间共同的电Jj(条带数目;N, 品种1中出现的电泳条带数目;N; 品手中J中出现的电泳条带数目;n -SSR标记数目。4 A. 1 主要仪器设备A. 1. 1 通用实验室仪器设备。A. 1.2 A. 1.3 A. 1.4 A. 1.5 A. 1.6 A. 1.7 A. 1.8 A. 1.9 A. 1. 10 A. 1. 11 A. 1. 12 A. 1. 13 A. 1. 14 A. 1. 15 A. 2. 1 乙二胶
14、囚A.2.2 =竣甲基罢王A.2.3 浓盐酸。A.2.4 氢氧化纳。A.2.5 氯化纳。A.2.6 石蜡油。A.2.7 去离子甲眈肢。A.2.8 澳盼蓝。A.2.9 二甲苯青。A. 2. 10 十二炕基磺酸纳。A. 2. 11 =氯甲炕。A. 2. 12 异戊醇。A. 2. 13 异丙醇。、20LA.2.14 N-N甲叉双丙烯戳胶(Bis)。A. 2. 15 丙烯眈胶(Acr)。A.2.16棚酸。A. 2. 17 尿素。0862月4094-2020附录A(规范性附录)主要仪器设备及试剂5 0862/T 4094-2020 A. 2. 18 亲和硅烧。A. 2. 19 剥离硅烧。A. 2. 20
15、 元水乙醇。A. 2. 21 四甲基乙二胶C1El在ED)。A. 2. 22 过硫酸绞C(NH3)zS203)。A. 2. 23冰醋酸。A. 2. 24硝酸银。A. 2. 25 甲酸。A. 2. 26 10 xPCR Buffer。A. 2. 27 PCR-Mix C天庚。A. 2. 28 Taq DNA聚合酶。A. 2. 29 SSR号|物。A. 2. 30 去离子水。A. 2. 31 聚丙烯眈胶胶液。A. 2. 32 DNA分析用分子量标记。6 8.1 DNA提取溶液的配制8. 1. 1 Imol!L氢氧化纳溶液称取40.0g氢氧化纳,8. 1. 2 0.5 mol/L 称职186.1一搅
16、拌。待乙二胶囚定容至1000mL,8. 1.3 1 量取258. 1 8. 1 8.1.7 5 M KAc 称职49.07gKAc, 8. 1. 8 3 M NaAc 附录B(规范性附录)溶液配制0862月4094-2020)准确调PH至8.0,8.0,加水定容至称取24.6g NaAc,窑解到90mLddH20,用HAC调节PH二52,ddH20定容至lmL。8. 1.9氯仿异戊醇(24)氯仿(CHCJ,)和异戊醇(C,H120)按24:1的比例(体积比)配制混合液。8.1.10 70%的乙醇溶液将350mL无水乙醇(C2H60)与150mL水混合为500mL70%的乙醇熔液。8. 1. 1
17、1 1E缓冲液7 0862/T 4094-2020 0.5 mol!L EDTA 1 mL. 1 mo1庄的Tris-HC15mL.加HCl调pH至8.0,加水定容至5mL,高压灭菌。8. 2 PCR扩增引物的配制用此旧20分别配制正向引物和反向引物浓度为10mol!L的工作液。8.3 变性聚丙烯1I:肢凝胶电泳溶液的配制8. 3. 1 IOx1BE缓冲液称职108.00g Tns罪口55.00g棚酸CH3B03)寄予水中,加入37mL 0.5 mol!L的Na2EDTA自液(PH80), 用蒸馆水定容至1000mL.高压灭菌。8. 3. 2 1xTBE缓冲液量取500mLlOxTBE缓冲液,
18、用去离子水定容至5000mL。8. 3. 3 40%丙烯1I:肢溶液称职190.00g丙烯眈胶(C,H,NO)和1O.00g甲叉双丙烯眈胶(H2C二CHCONH)zCH2),寄予400mL去离子水中,定容至500mL。8. 3. 4 6.0%变性聚丙烯1I:肢溶液称取420.00g尿素(CO(NH2)2)珞子水中,加入100mL IOxTBE缓冲液革口150mL40%丙烯眈胶熔液,过滤后加水定容至1000mL (黑暗,低温,玻璃瓶保存)。8. 3. 5 10 %过硫酸银溶液称取10.00g 过硫酸馁(NH4)2S208)珞子lmL水中。分装后保存于冰箱冷冻室中备用。8. 3. 6 6x上样缓冲
19、液取98mL去离子甲眈胶(CH3NO),加入2mLO.5mol庄的EDTA窑液、0.25g澳盼兰(C23H2.Br20,S)和0.25g二甲苯青(C25H27N206S2Na),摇匀,放入4-C备用。8.4 银染溶液的配制8. 4. 1 固定液量取100mL冰醋酸(C2H402),加入lOmL去离子水。8. 4. 2 染色液称职2.00g硝酸银(AgN03),珞子1000mL去离子水中。8. 4. 3 显影液称取15.00g氢氧化纳(NaOH), 珞子1000mL的蒸馆水中。使用之前加入4mL的甲酸(CH20)。8 0862月4094-2020附录C(规范性附录)引物信息茵蓓和箭警豌豆引物相关
20、信息分别见表C.l和C.2。序号引物MtTSSR-10 2-3-4-5-6-7-B-9-m-u一口-u-u-n-M一口-m-wMTRrniR077 MTRrniR078 MTRrniR079 退火温度/C打一打一打一打一打一打一打一打一打一打一打一打一打一打一打一打一打一打一打一打一20 I Mt-miRNA-SSR-7 CGCGGTCTTATTAGGGATCA 21 I Mt-miRNA-SSR-29 I AGCCTCTCAT寸TAATTGGTGCGCAGGTGCAAATGCAGATAA 57 叫Mt-mlRNA-SSR打TCCTTTGCTC甘CCAACTCTCCCCCT寸TGTTAGCAG
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