DB65∕T 4148-2018 牛环形泰勒虫病诊断技术规程(新疆维吾尔自治区).pdf
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1、DB65 ICS 11. 220 B 41 准标万由巴ITLF 区 J口自尔维-EE-E习新DB 65/T 4148-2018 牛环形泰勒虫病诊断技术规程-FtbE Diagnostic method of regulation for Bovine Theileriosis -EE-r-r2019 -01 -01实施2018 - 12 -01发布发布新疆维吾尔自治区市场监督管理局DB65/T 4148-2018 目IJ1=1 、,本标准按GB/T1.1-2009 标准化工作导则第1部分:标准的结构和编写的要求编制。本标准由新疆农业大学和吐克逊县畜牧兽医站提出。本标准由新疆维吾尔自治区畜牧厅归
2、口。本标准起草单位:新疆农业大学、托克逊县畜牧兽医站和吐鲁番市畜牧兽医站提出。本标准主要起草人:郭庆勇、巴音查汗盖力克、谢小婉、海尼木古力艾合买提、杜兰兰、张伟、郭子涵、沙塔尔卡哈尔、李才善、刘双、彭涛。-K-zD865/T 4148-2018 牛环形泰勒虫病诊断技术规程范围本标准规定了牛环形泰勒虫病技术诊断的术语和定义、诊断的技术要求。本标准适用于养牛场(户)、动物诊疗机构和动物防疫防控机构对牛环形泰勒虫病的防控。术语和定义2 下列术语和定义适用于本文件。2.1 -ELE牛环形泰勒虫病Bovinetheileriosis 牛环形泰勒虫病,是由泰勒虫属的环形泰勒虫(Theileriaannul
3、ata)寄生于动物红细胞和网状内皮系统、器官而引起的一种蝉传血液原虫病。世界动物卫生组织(OIE)将其定为B类疫病。本病的主要临床症状为稽留热、贫血和血虫症,其死亡率高。2.2 牛环形泰勒虫Theileriaannulata 牛环形泰勒虫,隶属于原生动物门(Protozoa)、复顶亚门picocomplexa)梨形虫纲(Piroplasmea)、梨形虫目(Piroplasmida)、泰勒科(Theileriidae)、泰勒属(Theileria)的环形泰勒虫(Theileria annulata)。2.2.1 配子体gametophy配子体寄生于红细胞,其形态为环形、戒指状(70%-80%)、
4、椭圆形、逗点状、杆状、十字形等:大小为0.8m-1.7m(详见附录C.l、C.2)。F 2.2.2 裂殖体schizont裂殖体又称石榴体或柯赫氏蓝体(kochsblue bodies) ,寄生于巨噬细胞、淋巴细胞等网状内皮细胞的胞浆内或散在于细胞外,呈圆形、肾形或者椭圆形(详见附录C.3)。FE-F-rt诊断牛环形泰勒虫病的诊断主要根据流行病学因素、临床症状、病理变化、病原学检测、血清学和分子生物学方法进行诊断。3 FE 根据流行病学诊断3.1 D865/T 4148-2018 3.1.1 传染源包括潜伏期感染牛、隐性感染牛、带虫牛和媒介蝉虫为传染源。3.1.2 传播途径该病经硬蝉(Ixod
5、es)传播而感染,媒介蝉叮咬牛属动物吮吸血液时,子抱子随唾液进入易感牛体内而感染。传播牛梨形虫的硬蝉有3属8种,其中新疆已被证实的媒介牌为小亚璃眼蝉、亚洲|璃眼牌、残缘璃眼蝉(璃眼蝉生物学特性见附录A、形态见附录B)。3.1.2.1 牛体表媒介蝉检查鉴定重点检查疑似牛的耳、颈部、腋下、腹部、股内侧、尾根等部位是否被硬蝉叮咬。采集时假头易拨断,需轻轻摇动,然后顺势拔下,除采集吸血饱满的雌蝉外,也要采集雄牌、若牌和幼牌。将每头牛体表采集的蝉虫放入相应编号的采集管内,以平均只数/牛个数计算密度(附录C.1)。送回实验室,进行鉴定媒介蝉种类及检测其携带的病原。如发现牛体表有与附录B相同的媒介蝉虫即可判
6、断为该牛疑似患有环形泰勒虫病。3.1.2.2 牛圈等环境中媒介蝉检查鉴定采集牛圈等环境的硬蝉时,重点检查天花板、墙缝内、土和砖块下,使用慑子采集。草场、运动场等野外采集蝉虫时常用布旗法(附录C.2)、兽皮法采集(附录C.4)在牛体表、周围环境及植被中发现媒介蝉虫是确诊的主要依据。3.1.3 易感动物按牛环形泰勒虫病的流行规律仔细分析其流行环节的同时,综合考虑媒介蝉等生物、环境因素,牛是易感动物,易感年龄段多为1岁3岁,带虫牛(感染过牛环形泰勒虫的牛只)的免疫可长达3年6年,易感牛多为外地引进牛。3.1.4 其他流行性特点牛环形泰勒虫病的感染程度因不同地区的气温、湿度、植被和媒介蝉种类及其活动季
7、节等因素而存在差异,每年5月中旬开始出现,但因当年气温的升高或降低也会出现上下浮动,6月7月达高峰,8月9月逐渐平息:耐过牛的免疫力可持续2.5年6年,长期带虫;据报道该病在我区的感染率可达60%,其急性病例死亡率较高。3.2 根据临床症状诊断3.2.1发病初期主要症状体温升高至390C41.80C,甚至可达420C,呈稽留热,少数病牛呈弛张热或间歇热。淋巴结肿大有痛感,眼结膜潮红:食欲减退,精神不振和呼吸、心律数增加:在红细胞内发现少量的虫体:淋巴结穿刺可见柯赫氏蓝体(石榴体),此期可延续2d5d。3.2.2 发病中期主要症状贫血,可视粘膜、虹门周围、乳房等薄皮肤处黄染或苍白:精神沉郁,食欲
8、废绝,便秘、腹泻交替,粪便常带粘液或血,尿黄,无血尿,迅速消瘦:体表淋巴结肿胀,血液稀释,血沉加快,红细胞染虫率逐步增高。一-FirLE2 E D865/T 4148-2018 3.2.3 发病后期主要症状病畜食欲废绝,反鱼完全停止,卧地不起,在眼险、尾根和稚嫩的皮肤上出现粟粒以至扁豆大小的深红色结节状的淤血斑点,趋于死亡征兆,死亡常发生在发病后的1周2周:耐过的牛,若能得到良好的护理,病情逐渐好转,自愈后成为带虫牛。3.3 病理诊断全身性出血、全身淋巴结肿大及皱胃蒙古膜有溃殇斑:脾脏、肝脏、肾脏肿大,肺有水肿和气肿,被膜有出血点;严重病例粘膜病变面积可占1/2以上:尸僵明显,全身皮下、肌间、
9、粘膜上均可见大量的出血点和出血斑:红细胞溶血、血项有不同程度变化。3.4 病原学诊断病原学诊断包括血液型虫体的鉴定和组织型虫体(石榴体的鉴定。3.4.1 血液型虫体的鉴定经血液涂片染色,在显微镜下检查发现血液型虫体是确诊的主要依据(镜检方法见附D)。镜下观察到与附录E.1、E.2相同虫体即可确诊。3.4.2 组织型虫体的鉴定该病初期,虫体一般侵袭患病宿主的网状内皮系统(淋巴结、脾脏等),检查发现脏器型虫体是确诊依据。制作涂抹片(制作方法见附录D)后在显微镜下观察到与附录E.3相同的石榴体可判定为感染牛环形泰勒虫病。3.5 牛环形泰勒虫病血清学诊断3.5.1 rELISA检测酶联免疫吸附试验(r
10、ELISA)检测,被检血清值高于标准阳性血清平均值判定为阳性结果。(附录F) 3.5.2 cELISA检测根据商品化试剂盒检测结果判定详见附录G)3.6 分子生物学诊断根据PCR检测结果判定(样品包括血源性环形泰勒虫和蝉源性环形泰勒虫。3.6.1二温式PCR根据二温式PCR检测结果判定(详见附录H)。3.6.实时荧光定量PCR根据实时荧光定量PCR检测结果判定(详见附录。3 E . F I. D865/T 4148-2018 附录A(资料性附录)璃眼虫草生物学特性uw rpau-E 图A.1璃眼蝉/二宿主蝇模式图. . EFEEl-4 图A.2环形泰勒虫子抱子阶段入侵璃眼虫草唾液腺(AlanR
11、 Walker, 2012) DB65/T 4148-2018 附录B(资料性附录)新疆牛环形泰勒虫病主要媒介蝉种类及形态B.1璃眼蝉类CHyalommaSpp.) 新疆4种优势璃眼蝉背腹面形态结构对比见图B.1说明:A.小亚璃眼蝉背面观B.小亚璃眼蝉腹面观c.小亚璃眼蝉虹板D.小亚璃眼蝉气门板E.亚洲、|璃眼蝉背面观F.亚洲|璃眼蝉腹面观G.亚洲璃眼蝉旺板H.亚洲璃眼脾气门板1.残缘璃眼蝉背面观.残缘璃眼蝉腹面观K.残缘璃眼蝉旺板L.残缘璃眼蝉气门板M.嗜驼璃眼蝉背面观N.嗜驼璃眼蝉腹面观o.嗜驼璃眼蝉旺板P.嗜驼璃眼蝉气门板图B.1光学显微镜下新疆4种优势璃眼虫草背腹面形态结构对比EEEF
12、EF-. -F 5 t ., 、D865/T 4148-2018 表B.l光学显微镜下新疆4种优势璃眼蝉背腹面形态结构对比特征小亚璃眼蝉亚洲璃眼蝉残缘璃眼蝉嗜驼璃眼蝉H.anatolicumanatoli H.asiaticumasiaticu H. dromedarii 结构H. detritum cum m 躯体呈长卵圆形,长与宽约呈卵圆形,长与宽约呈矩形,长与宽约呈矩形,长与宽约4. 2X2. 2 mm; 4. 7X3. 0 mm; 5. 5X2. 8 mm; 4. 8X2. 5 mm; 假头假头长,略似方形假头较长,假头基后缘假头长,假头基与须肢假头基矩形内凹较深连接处宽基节I外距明显
13、长于内距外距与内距约等长,末外距较内距约等长,末外距比内距长,端部略端略向外呈弯端略向外弯向外弯虹侧板中部较宽,前端胚侧板尖长,内缘凸角胚侧板较宽短,内缘凸虹侧板较短,内缘凸角胚板尖窄,后缘较圆钝,副较宽,呈一角形尖突:角粗短;副胚侧板末端窄长:胚下板大,比副虹侧板适中,旺下板较副旺侧板适中:旺下板宽斜;胚下板较短小,虹侧板宽较小,位于胚侧板下方位于胚侧板下方气门板似匙形,背突较宽而曲颈瓶形,背突窄而逗点状,背突渐细,末似匙形,背突渐窄,末长,末端达盾板边缘长,末端达盾板边缘端略上翘端达盾板边缘颈沟前端深陷,而后渐浅,颈沟深而长,相当明前端深陷,延伸至盾板宽而深,而后显著变浅达盾板后侧缘显,末
14、端达盾板后侧缘后侧缘粗长适中,关节附近有细长,以第3、4对略细长,色淡,各关节附较粗壮,黄褐色,在各足粗,在关节附近有淡色明显的淡色环带近无淡色关节附近具淡色环带环带rFE-E一6 F DB65/T 4148-2018 附录C(规范性附录)牛体重估测法及媒介蝉的采集法C.1 体重估测公式公式参见于:公式胸围2(cm) x体斜长(cm)/10800=体重(kg)j主:胸围是从肩脚后角围绕胸围一周的长度:体斜长指肩关节到坐骨结节的直线距离10800为常数。C.2 布旗法(人工小时布旗法)用1m2大小的白绒布旗,在有媒介蝉地带进行定时拖牌。操作时,手持旗杆伸向一侧,使旗子平铺于草丛上,以等速缓步向前
15、行,每步行10m停下观察一次,将附于旗上的蝉捡入采集瓶内。每面旗子整个过程共进行1h。C.3 媒介蝉种群组成(优势种群)(Dr) = (Ni/N) x100 % (N为家畜体表寄生牌总个体数,Ni为某种蝉的个体数)C.4 兽皮法:用屠宰动物的新鲜皮(牛、羊等动物皮,粘膜面朝上,被毛面朝下)代替布旗,在有媒介蝉地带进行定时拖牌。拖皮行走每隔50m,-.,100 m检查一次兽皮,收集其上蒙古贴的蝉虫。注:一般2月下旬开始发病,3月4月达到高峰,5月逐渐减少,9月可二次流行。南北疆发病时间稍有差异,一般北疆较南疆晚:牛泰勒虫病的流行季节较驾巴贝斯虫病稍晚,但两者常呈混合感染。一-FfLEEFEEF一
16、口FE 7 D865/T 4148-2018 附录D(规范性附录)病原学诊断方法血液型虫体鉴定方法D.l 主要设备、材料和试剂冰箱、离心机、光学显微镜、体视显微镜、移液器、吸头、离心管、载玻片;无菌注射器或真空采血管、EDTA溶液、抗凝剂、染色液等。D.1.1 血液样品采集从疑似牛类动物耳尖或尾根部无菌采血约10m1,分别加入到含有抗凝剂EDTA溶液的抗凝管(用于血液涂片和核酸提取和不含抗凝剂的采血管内(用于分离血清), -20oC保存待检。D.1.2 -FELE 血液涂片制作为法D.1.4.1 血液涂片制作:取干净无残缺的载玻片两张(推片、涂片各一片。干净滴管滴一滴水珠大小牛全血于载玻片上,
17、450匀速向前推片,自然晾干。D.1.4.2 固定:自然晾干,甲醇固定,再自然晾干。以上两个步骤一般在采血现场进行。D.1.4.3 染色和冲洗:姬姆萨染液进行染色1.5min;蒸馆水冲洗干净,自然晾干。D.1.4.4 观察血液内的裂殖子:染好的血涂片置于显微镜上,在涂片区域滴上香柏油,置于10 xl00倍的光学显微镜下进行观察计算染虫率。D.1.3 显微镜下检查在干燥后的血膜表面滴加一滴松柏油,将血膜放在100倍的显微镜下进行观察,当镜下发现与附录E相同的典型血液型虫体即可判定为阳性。D.1.4 组织型虫体鉴定方法D.2 主要设备、材料和试剂D.2.1 参见D.1. 1。活体和死亡牛淋巴、组织
18、样品从疑似牛类动物的肩前淋巴结或腹股沟淋巴结进行无菌穿刺,用干燥注射器抽取淋巴内容物;也可无菌采集淋巴结、脾脏等用于制作抹片样品。病死动物采样时,死亡时间不超过24h,采集脑、淋巴结、心、肝、和脾等脏器组织样品,样品在40C左右条件下迅速送达实验室。D.2.2 溶液自己制D.2.3 参见D.1.3.1。EE-LEt-FZ=r 操作方法将载玻片轻轻触碰脏器切面或轻推淋巴液使淋巴液在玻片上形成一张薄的膜。涂抹片制成后,待自然干燥后,在涂抹片表面滴加甲醇进行固定。待甲醇在空气中干燥后,对涂抹片进行染色。将姬姆萨染液滴力日在血膜上,使涂抹片被染液覆8 D.2.4 D.2.4.1 D.2.4.2 D.2
19、.4.3 DB65/T 4148-2018 盖,染色列min。D.2.4.4 染色列min后,用清水轻轻洗去载玻片表面的染液,待载玻片表面干燥后用铅笔或标签纸在涂抹片的另一侧进行编号。-KLZZ 显微镜下检查在干燥后的涂抹片表面滴加一滴松柏油,将血膜放在100倍的显微镜下进行观察,当镜下发现与附录E相同的典型石榴体P可判定为阳性。D.2.5 EEE-FFFr E 9 附录E(资料性附录)牛环形泰勒虫病原形态图E.1牛环形泰勒虫病虫体模式图图E.2牛环形泰勒虫病血液型虫体实物(阳性病例血液涂片)s 图E.3牛环形泰勒虫石榴体(阳性病例淋巴结涂抹片)DB65/T 4148-2018 -LKEE10
20、 E了DB65/T 4148-2018 附录F(规范性附录)rELISA操作方法用于检测抗体的间接ELISA试剂配方。F. 1 包被缓冲液配置见表F.1 包被缓冲液(100此)表F.l0.159 g 0.293 g Na2C03 NaHC03 注:调节pH=9.6,ddH20定容至100mL后,放于40C冰箱保存PBST溶液配置见表F.2一-FrLEPBST (10倍1000mL) KH2P04 2g Na2HP04. H20 35.8 g NaCl 80 g KCl 2g Tween20 5 mL (调节pH后再加注:调节pH=7.4,须高压后加入Tween20时须剪掉部分枪头,ddH20定
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