DB37∕T 3316-2018 鸡J-亚群白血病实验室诊断技术(山东省).pdf
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1、ICS 65.020.30 B45 DB37 山东省地方标准 DB 37/T 33162018 鸡 J-亚群白血病实验室诊断技术 Laboratary Diagnostic Technique of Chicken Leukosis Virus Subgroup J (ALV-J) 2018 - 06 - 12 发布 2018 - 07 - 12 实施 山东省质量技术监督局 发 布 DB37/T 33162018 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会提出并归口。 本标准主要起草单位:山东农业大学。
2、 本标准主要起草人:成子强。 DB37/T 33162018 1 鸡 J-亚群白血病实验室诊断技术 1 范围 本标准规定了我省针对ALV-J的检测诊断方法。 本标准适用于判断鸡群是否患J亚群白血病。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 2.1 禽白血病病毒J亚群 Avian Leukosis Virus Subgroup J . ALV-J ALV-J属反转录病毒科甲型反转录病毒属,是单股正链RNA病毒。ALV-J主要特点是引起多种禽类免疫抑制和髓细胞性白血病发生,对养鸡业威胁巨大。 2.2 抗原/抗体检测 通过标准的酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorb
3、ent assay,ELISA)检测ALV-J的抗原/抗体。应用指定的商品化ALV-J抗原/抗体检测试剂盒,用血清检测ALV-J抗体,用棉拭子检测ALV-J群特异性抗原(p27)具体实验步骤参照GB/T 26436。抗体及p27均呈阳性,或二者之一呈阳性,可怀疑ALV-J感染。 2.3 PCR 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)。 2.4 RT-PCR 反转录-聚合酶链反应(reverse transcription PCR,RT-PCR)。 3 材料与试剂 3.1 常规使用的 ELISA 抗原/抗体检测试剂盒 (IDEXX)。 3.2 常规使用的商品化
4、的 RNA 提取试剂盒。 3.3 常规使用的商品化的 RNA 反转录试剂盒。 3.4 各检测方法所需的试剂。 3.4.1 PBS 缓冲液见附录 A 中 A.1。 3.4.2 灭菌水。 DB37/T 33162018 2 3.4.3 蒸馏水。 3.4.4 细胞生长培养基见附录 A 中 A.2。 3.4.5 细胞维持培养基见附录 A 中 A.3。 除另有规定外,所有化学试剂均为分析纯。 4 仪器与设备 4.1 全自动高温高压灭菌锅 (温度范围:105-134;额定压力:0.23Mpa)。 4.2 低速离心机。 4.3 PCR 仪。 4.4 二氧化碳恒温细胞培养箱。 4.5 液氮储存罐。 4.6 研
5、磨器。 4.7 手术剪。 4.8 各量程移液枪。 4.9 超低温冰箱。 4.10 酶标仪。 4.11 分光光度计 5 抽样 5.1 样品采集 5.1.1 组织样品的采集 按1 %的比例,随机选取疑似J亚群禽白血病病鸡,用无菌手术剪分离肾脏、肝脏、脾脏等所需脏器100 mg 分装于1 mL 储存管内,并及时冻存于-80 冰箱或液氮罐内备用。 5.1.2 血液样品的采集 用2.5 mL无菌注射器于翅下静脉或颈静脉抽取1 mL左右的静脉血,放入编号离心管内,倾斜静置,待血液分离出血清后吸取血清于编号的离心管内,储存于-20 冰箱备用。 5.1.3 泄殖腔棉拭子的采集 用无菌棉签插入泄殖腔内,擦拭后将
6、棉签放入装有1 mL PBS缓冲液的离心管内,储存于-20 冰箱备用。 5.2 样品运输与存放 采集的样品应放入冻存管并放入冰盒内运输 ,然后上述要求及时放入液氮罐或-80 冰箱或-20 冰箱储存。 6 操作方法 6.1 方法 DB37/T 33162018 3 6.1.1 抗原/抗体检测 抗原/抗体检测是采用美国IDEXX 公司的ELISA检测试剂盒检测。 6.1.1.1 样品处理 检测样品前,棉拭子应反复冻融2 次3 次,4 ,1006.2g (3000转)离心2 min3 min,吸取上清。血清样品于室温融化, 500 倍稀释,用于检测。 6.1.1.2 操作步骤 按照试剂盒提供的检测步
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