2015免疫实验加样枪的使用-演示文稿.ppt
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1、实验一实验一练习加样抢的使用练习加样抢的使用1.练习加样抢的使用:练习加样抢的使用:重重复复性性操操作作实实验验:(加加低低浓浓度度的的重重铬铬酸酸钾钾黄黄色色液液体体),每每孔孔100ul。加加32孔孔,每每位位同同学学需需要要一一块块空空板板加加样样,450nm比比色色后后计算各自的计算各自的cv值值.2.加样枪的使用与维护 加样枪的使用1、量程的调节 2、枪头(吸液嘴)的装配 3、移液的方法 加样枪的维护保养使用的注意事项加样枪的使用量程的调节 转动加样枪顶部的按钮进行移液量的设定。在调节量程时,如果要从大体积调为小体积,则按照正常的调节方法,逆时针旋转旋钮即可;但如果要从小体积调为大体
2、积时,则可先顺时针旋转刻度旋钮至超过量程的刻度,再回调至设定体积,这样可以保证量取的最高精确度。(在该过程中,千万不要将按钮旋出量程,否则会卡住内部机械装置而损坏了移液枪。)枪头(吸液嘴)的装配 在将枪头套上移液枪时,很多人会使劲地在枪头盒子上敲几下,这是错误的做法,因为这样会导致移液枪的内部配件(如弹簧)因敲击产生的瞬时撞击力而变得松散,甚至会导致刻度调节旋钮卡住。正确的方法是将移液枪(器)垂直插入枪头中,稍微用力左右微微转动即可使其紧密结合。如果是多道(如8道或12道)移液枪,则可以将移液枪的第一道对准第一个枪头,然后倾斜地插入,往前后方向摇动即可卡紧。枪头卡紧的标志是略为超过O型环,并可
3、以看到连接部分形成清晰的密封圈。移液的方法 移液之前,要保证移液器、枪头和液体处于相同温度。吸取液体时,移液器保持竖直状态,将枪头插入液面下1厘米。在吸液之前,可以先吸放几次液体以润湿吸液嘴尤其是要吸取粘稠或密度与水不同的液体时。注意吸液体时,一定要缓慢平稳的松开拇指,绝不允许突然松开,以防将溶液吸入过快而冲入移液器内腐蚀柱塞而造成漏气。u前进移液法前进移液法a)用大拇指将按钮按下至第一停点。b)将吸头插入液面下1厘米深处并慢慢松开按钮回原点,待管嘴吸入溶液后,将管嘴撤出液面并斜贴在试剂瓶壁上淌走多余的液体。c)将加样枪移至待加入液体的容器,让吸头位于容器液面的近上方。轻轻压上按钮至第一停点排
4、出液体,待一秒钟后继续按按钮至第二停点吹出残余的液体,并让吸头尖部轻轻接触液面上方的容器壁,以免产生气泡。d)继续按住按钮,撤出加样枪后松开按钮使之返回按钮起点位置。u反向移液法(略)反向移液法(略)此法一般用于转移高粘液体、生物活性液体、易起泡液体或极微量的液体,其原理就是先吸入多于设置量程的液体,转移液体的时候不用吹出残余的液体。a)先按下按钮至第二停点位置b)将吸头插入液面下23毫米深处并慢慢松开按钮至原点。待管嘴吸入溶液后,将管嘴撤出液面并斜贴在试剂瓶壁上淌走多余的液体。c)将加样枪移至待加入液体的容器,让吸头位于容器液面的近上方。轻压下按钮按至第一停点排出液体。d)继续保持按住按钮位
5、于第一停点(千万别再往下按),取下有残留液体的枪头,弃之。u重复操作移液法(略)重复操作移液法(略)适用于快速、简便地重复转移等量的同种液体。a)先按下按钮至第二停点位置b)将吸头插入液面下1厘米深处并慢慢松开按钮回原点,待管嘴吸入溶液后,将管嘴撤出液面并斜贴在试剂瓶壁上淌走多余的液体。c)将加样枪移至待加入液体的容器,让吸头位于容器液面的近上方。轻压下按钮按至第一停点排出液体。d)继续保持按住按钮位于第一停点(千万别再往下按),重复步骤b和c,就可多次复重移取等体积的同种液体。u全血移取法(略)全血移取法(略)a)采用前进法步骤a和步骤b使吸头吸满血液,用干净的干燥薄棉纸小心将吸头外的血液擦
6、干净。b)将吸头浸入液面下,然后将按钮压至第一停点位置,操作时务必确保吸头始终于液面之下。c)慢慢松开按钮让按钮回到起点位置,使吸头内吸入试剂,再按下按钮至第一停点位置,然后慢慢松开按钮。重复此项操作直至待转移的液体(如全血)全部转移至溶液中。最后,再按下按钮至第二停点位置,将吸头内的液体(全血)彻底放干净即可。操作时应注意使吸头始终位于液面之下。加样枪的维护保养如不使用,要把移液枪的量程调至最大值的刻度,使弹簧处于松弛状态以保护弹簧。并将其竖直挂在移液枪架上,每天使用完后,应对加样枪外表面进行清洁,特别需要注意加样枪嘴锥处,不能残留溶液(血液)。用10%的次氯酸钠溶液或70%的酒精溶液清洁后
7、,自然晾干。微量加样枪必须按要求定期进行校准。(低于10ul的移液器每半年送华南计量研究所进行校准。其它型号的移液器每半年校准一次,由被授权的人员完成。)使用的注意事项设定加样体积,不能大于加样枪标定的移液范围加样吸头的装配(前面已提到)每次吸样应更换加样吸头,防止交叉污染。加样前,一定要检查吸头是否上紧,以免液体漏出或取液不准。方法是吸取液体后悬空垂直放置几秒中,看看液面是否下降。要保证在整个吸液过程中,吸头尖端要一直处于液面之下,即防止吸空造成吸样不准确。吸取液体完成后排出液体之前,一定要擦去吸头四周的液体,特别是在取液量较少时尤其要注意这一点。但要防止接触吸头尖端。吸取液体和排出液体动作
8、都一定要慢,因为动作过快,液体因表面张力吸附在吸头壁上,造成移液不准。所取液体的粘度越高,越应该注意这个问题。排出液体时,在液体将排尽时,要轻轻让吸头尖端接触容器壁,以免在加样的容器中形成气泡,影响后续反应。加样完成后,应在弃去使用过的吸头后,方才松开按钮至起始位置,以免吸头内的残留液体回吸到枪头,造成交叉污染。当移液器枪头里有液体时,切勿将移液器水平放置或倒置,以免液体倒流腐蚀活塞弹簧。吸取液体时,一定要缓慢平稳的松开拇指,绝不允许突然松开,以防将溶液吸入过快而冲入移液器内腐蚀柱塞而造成漏气。加样枪严禁吸取有强挥发性、强腐蚀性的液体(如浓酸、浓碱、有机物等)不要用大量程的加样枪移取小体积的液
9、体,以免影响准确度。所使用的加样枪应在校正期限内。实验二实验二练习加样抢的使用练习加样抢的使用1.计算每位同学倍比稀释的准确性。在酶标板第一孔加重铬酸钾黄色液体200ul,往右4孔每孔加DH2O100ul,从第一孔吸出100 ul重铬酸钾黄色液体往右做倍比稀释,共做4行后,450nm比色计算其倍比稀释的cv值.2.1000倍稀释方法的计算及使用:倍稀释方法的计算及使用:100ul+900ul稀释稀释10倍倍10ul+990ul稀释稀释100倍倍或或第第一一部部50倍倍稀稀释释,第第二二部部20倍倍稀稀释释?实验二实验二双向免疫扩散试验双向免疫扩散试验说明:可溶性抗原与相应抗体在半固体琼脂介质中
10、相说明:可溶性抗原与相应抗体在半固体琼脂介质中相互扩散,相遇后发生特异性结合,出现可见的沉淀线。互扩散,相遇后发生特异性结合,出现可见的沉淀线。在琼脂凝胶中,待检人血清在琼脂凝胶中,待检人血清IgG和羊抗人和羊抗人IgG抗血清在不同孔内各自向四周扩散,在比例抗血清在不同孔内各自向四周扩散,在比例恰当处形成肉眼可见的白色沉淀线,证明两者恰当处形成肉眼可见的白色沉淀线,证明两者发生特异性结合反应。发生特异性结合反应。实验原理实验原理试剂试剂健康人血清,用生理盐水做健康人血清,用生理盐水做1:51:40系列倍比稀释系列倍比稀释、羊、羊抗抗人人IgG抗血清、抗血清、1015g/L琼脂糖或琼脂粉琼脂糖或
11、琼脂粉。仪器仪器水浴箱、温箱水浴箱、温箱。材料材料载玻片、微量加样器、打孔器、载玻片、微量加样器、打孔器、5ml吸管、吸球、湿盒吸管、吸球、湿盒等等。实验器材和材料实验器材和材料制备琼脂凝胶制备琼脂凝胶:用生理盐水配置:用生理盐水配置1015g/L琼脂,隔水加热煮沸备用。琼脂,隔水加热煮沸备用。浇板浇板:将载玻片置于水平台上,用吸管吸取:将载玻片置于水平台上,用吸管吸取44.5ml融化的琼脂倾注于玻片上,滴融化的琼脂倾注于玻片上,滴加时注意速度不要过快,要使琼脂盖满整张玻片,使其均匀、饱满,勿溢出并避免加时注意速度不要过快,要使琼脂盖满整张玻片,使其均匀、饱满,勿溢出并避免产生气泡。产生气泡。
12、打孔打孔:待琼脂凝固后,将梅花形打孔模板待琼脂凝固后,将梅花形打孔模板置置于琼脂板下,用直径于琼脂板下,用直径3mm的打孔器打的打孔器打孔,使其孔径为孔,使其孔径为3mm,孔距为孔距为4mm,孔要求圆整光滑,孔缘不能破裂,底部勿与载孔要求圆整光滑,孔缘不能破裂,底部勿与载玻片脱离。玻片脱离。加样加样:用:用10l微量加样器分别取抗原、抗体加入孔中。微量加样器分别取抗原、抗体加入孔中。中心孔加入抗体中心孔加入抗体,周围孔分别加入不同稀释度的抗原。周围孔分别加入不同稀释度的抗原。温育温育:将加好样的琼脂凝胶板平放于湿盒中,:将加好样的琼脂凝胶板平放于湿盒中,37温箱温育温箱温育24h,观察沉淀观察
13、沉淀线。线。实验方法操作示意图操作示意图浇板浇板温育温育打孔打孔加样加样结果判断结果判断中央孔中央孔抗体成分抗体成分周围孔周围孔不同稀释度的抗原成分(第不同稀释度的抗原成分(第1 15 5孔)孔)第第6 6孔孔阴性对照阴性对照123456浇板浇板温育温育打孔打孔加样加样结果判断结果判断中央孔中央孔抗体成分抗体成分周围孔周围孔不同稀释度的抗原成分(第不同稀释度的抗原成分(第1 15 5孔)孔)第第6 6孔孔阴性对照阴性对照孔径:孔径:3 3mm,mm,孔距:孔距:4 4mmmm以出现沉淀线的正常人血清最高稀释度为以出现沉淀线的正常人血清最高稀释度为人血清人血清IgG的扩散效价。的扩散效价。结果判
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