DB21∕T 3095-2018 犬非结核细菌性肺炎诊断技术规范(辽宁省).pdf
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1、ICS 11.220 B 41 DB21 辽宁省地方标准 DB21/T 30952018 犬非结核细菌性肺炎诊断技术规范 The technical Specification for diagnostic bacterial of Non-tuberculosis mycobacteria pneumoniae for canine 2018 - 12 - 25 发布 2019 - 01 - 25 实施 辽宁省市场监督管理局 发 布 DB21/T 30952018 I 目 次 前 言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 3.1 肺炎 pneumon
2、ia . 1 3.2 非结核细菌性肺炎 bacterial of Non-tuberculosis mycobacteria pneumoniae . 1 3.3 感染 infection . 1 3.4 16SrRNA . 1 4 诊断 . 1 4.1 流行病学特点 . 2 4.2 临床症状诊断 . 2 4.2.1 呼吸系统症状 . 2 4.2.2 发热及相关症状 . 2 4.2.3 其它方面症状 . 2 4.3 影像学特征 . 2 4.4 外周血检查特征 . 2 4.5 病原学检测 . 2 4.5.1 细菌分离培养和涂片镜检 . 2 4.5.2 生化试验 . 2 4.5.3 致病性检验 .
3、 3 4.5.4 分子生物学鉴定 . 3 5 诊断结果判定 . 3 5.1 初步诊断 . 4 5.2 确诊 . 4 6 鉴别诊断 . 4 附录 A(资料性附录) 细菌性肺炎主要致病菌分离鉴定具体方法和结果判定依据 . 5 附录 B(资料性附录) 犬细菌性肺炎的鉴别诊断 . 10 DB21/T 30952018 II 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草 本标准由辽宁省畜牧兽医局提出并归口。 本标准起草单位:锦州医科大学、鞍山动物检疫站、本溪市动物疫病预防控制中心等单位。 本标准主要起草人:周铁忠、毕聪明、盛鹏飞、李春宵、陈勇、张建平、马强、赵岩、郭维军、杨丽、赵刚、刘建华、
4、朱绪银、高蕾、李德臣、金娜、高柏华、张娜、宋志永、宋宝强、高峰、孙传禄、徐畅、何礼。DB21/T 30952018 1 犬非结核细菌性肺炎诊断技术规范 1 范围 本标准规定了犬非结核细菌性肺炎诊断的技术方法、诊断依据和鉴别诊断。 本标准适用于我省动物诊疗单位及兽医工作者对犬非结核细菌性肺炎的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。 凡是注日期的引用文件, 其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。但是,鼓励根据本标准达成协议的各方研究使用这些文件的最新版本。 GB/T6682 分析实验
5、室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 肺炎 pneumonia 指终末气道、肺泡和肺间质的炎症,可由病原微生物、理化因素、免疫损伤、过敏及药物所致。按病因可分为细菌性肺炎(肺炎链球菌、支气管败血波氏杆菌、金黄色葡萄球菌等),非典型病原体所致肺炎(支原体、衣原体、军团菌),病毒性肺炎,肺真菌性肺炎,其他病原体所致肺炎(立克次氏体、弓形体、肺寄生虫等),理化因素所致肺炎。 3.2 非结核细菌性肺炎 bacterial of Non-tuberculosis mycobacteria pneumoniae 细菌性肺炎指由肺炎链球菌、支气管败血波氏杆菌、金黄色葡萄
6、球菌等主要病原菌引起的肺炎,不包括结核分枝杆菌所致的肺结核。为了严格区分本标准将细菌性肺炎定义为“非结核细菌性肺炎”。 3.3 感染 infection 病原微生物侵入动物机体,并在一定部位定居,生长繁殖,从而引起机体一系列病理反应,这个过程称为感染。 3.4 16SrRNA 16SrRNA基因是细菌上编码rRNA相对应的DNA序列,存在于所有细菌的基因组中;16SrRNA具有高度的保守性和特异性以及该基因序列足够长(包含约50个功能域)等特征,所以,16SrRNA基因检测技术可做为病原菌检测和鉴定的主要方法,应用该技术可以实现对病原菌进行快速、微量、准确简便地分类鉴定和检测。 4 诊断 DB
7、21/T 30952018 2 依据流行病学特点、临床症状及影像学特征等作出初步诊断,确诊需做病原学检测。 4.1 流行病学特点 在发病前有接触感染病原微生物的病犬或带菌犬, 如引入新的病犬未隔离就混群, 或居住或到过细菌性肺炎流行的区域;发病率高,但致死率低,主要为4月龄以内的幼犬发病,成年犬少见发病;发病前有春秋季节交替、环境温度突变、长途运输等应激因素,导致抵抗力下降,诱发条件性致病菌大量繁殖而发病。 4.2 临床症状诊断 4.2.1 呼吸系统症状 表现为咳嗽,痰液脓汁样黄白色或铁锈样或带血,有时流鼻汁;呼吸急促,呼吸困难,如舌头青紫及鼻翼扇动,重者呈点头状呼吸、呼气时间延长、出现胸壁吸
8、气性凹陷或呻吟等;胸部听诊肺泡呼吸音消失,支气管呼吸湿啰音,健康部位则肺泡音高朗,继发胸膜炎可听到胸膜摩擦音;胸部叩诊有局灶性或大面积浊音区。 4.2.2 发热及相关症状 体温升高至 39.5 以上,表现精神沉郁,食欲减退或废绝,结膜潮红或蓝紫。 4.2.3 其它方面症状 重症肺炎引发心力衰竭,出现心率加快,心率不齐,脉搏微弱,可视粘膜明显发绀,颜面眼睑或双下肢水肿等症状。引发缺氧中毒性脑病时出现烦躁、眼球上窜、凝视,昏睡、昏迷、惊厥等症状,发生缺氧中毒性肠麻痹时出现频繁呕吐、严重腹胀等症状。 4.3 影像学特征 胸部X线检查显示肺纹理增粗,片状、斑片状、大片状阴影和实变影,可伴有支气管充气征
9、、液气囊腔和肋膈角胸腔积液。 4.4 外周血检查特征 采集犬前肢头静脉(前臂头静脉)或后肢隐静脉或颈静脉血液样本1.0ml,采用血液分析仪或人工计数方法进行外周血白细胞计数和分类计数。 应用血细胞分析仪计数方法按其说明书处理血液样本, 进样检测,仪器自动分析、打印结果。人工计数方法取1滴外周血,滴于洁净无油脂的玻片制取血涂片,应用瑞氏(Wrights)染色法和姬姆萨(Giemsa)染色法进行染色,通过显微镜观察染色血涂片,计算血液中各类白细胞的数量和百分率。 细菌性肺炎白细胞计数明显升高,其中中性粒细胞比例显著升高,并有核左移现象。 4.5 病原学检测 4.5.1 细菌分离培养和涂片镜检 无菌
10、操作采取气管吸取物、肺泡灌洗液、胸水、脓液和血液,于血液肉汤培养基中37增菌10h后再划线接种于血液琼脂平板和胰蛋白胨大豆琼脂平板培养基,37培养1824h后观察有无菌落生长;挑取单个菌落进行染色、镜检,观察细菌的形态。 4.5.2 生化试验 DB21/T 30952018 3 挑取单个分离菌接种于细菌微量发酵管中,37培养1824h,观察、记录生化反应结果。 4.5.3 致病性检验 将分离菌的纯培养物接种于脑心浸液中37培养1824h,并计算活菌数。选取5只健康小鼠,每只腹腔注射菌液0.25ml(2.1 108 CFU/ml)菌液;另取5只体重相近的健康小鼠,每只腹腔注射等量灭菌脑心浸液。小
11、鼠攻毒后连续7天观察临床表现及死亡情况。取发病死亡小鼠的肺、肝接种血液琼脂平板等培养基,均生长出与原分离菌相同的菌。 病原学检测有关试验使用蒸馏水按国家标准 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 要求准备。 4.5.4 分子生物学鉴定 4.5.4.1 应用 16SrRNA 基因序列分析法鉴定细菌, 首先合成用于扩增细菌 16SrRNA 基因序列的通用引物: 27f: 5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3; 1492r: 5- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3。目的基因1492bp 4.5.4.2 按照通用型柱式基因组提取试剂盒说明书提取待检病料所分离培养的细
12、菌基因组 DNA,然后在 PCR 反应管中按相应反应体系加入提取的 DNA(3L)、上下游引物(各 1L)、Taq Mix(15L)、ddH2O(10L)等试剂; 4.5.4.3 应用 PCR 扩增仪按相应反应条件进行扩增。 PCR 反应条件:94预变 5min;94变性 30s,55退火 30s;72延伸 30s,35 个循环;72延伸 10min;4终止反应。对 PCR 扩增产物进行 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,得到目的片段后,按照琼脂糖凝胶胶回收试剂盒(OMEGA)的说明及步骤对 PCR 扩增产物进行回收和纯化,回收产物作为测序模板进行测序,测序要求测通。 4.5.4.4 对所测出的基因
13、序列进行同源性比对分析,即登陆 NCBI 网站(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov)的 Blastn 在线软件,粘贴测序所得的 16S rRNA 基因序列,获取与该基因同源高的序列和相应的细菌名称,若同源性大于 97%,可以确定为同种细菌。 16SrRNA基因序列分析法鉴定细菌PCR扩增产物电泳参考图: 图1 鉴定菌株 16SrRNA PCR 电泳图 注:MDL2000 DNAMarker; 1.阳性对照;2-6.阳性扩增产物;N.阴性对照 细菌性肺炎主要致病菌分离培养和形态特征、 生化鉴定以及分子生物学鉴定具体方法和结果判定依据见附录1 5 诊断结果判定 DB21/T 30
14、952018 4 5.1 初步诊断 根据流行病学特征和典型临床症状,结合外周血、X线影像学特征,可作出初步诊断。 5.2 确诊 依据病原学检测结果,确定是何种细菌感染,做出确诊。 6 鉴别诊断 需要与细菌性肺炎进行鉴别的重点疾病包括上呼吸道感染、犬副流感病毒感染、肺炎支原体肺炎、肺炎衣原体肺炎、军团菌性肺炎、真菌性肺炎、病毒性肺炎、肺结核。其它需要鉴别的疾病还包括肺部肿瘤、肺水肿、肺气肿、理化因素所致非感染性肺炎等。 需要与细菌性肺炎鉴别的重点疾病的具体鉴别诊断要点见附录2 A DB21/T 30952018 5 附 录 A (资料性附录) 细菌性肺炎主要致病菌分离鉴定具体方法和结果判定依据
15、一、链球菌的分离鉴定 1.细菌学鉴定 1.1细菌的分离培养 无菌操作采取气管吸取物、肺泡灌洗液、胸水、脓液和血液,于血液肉汤培养基中37增菌10h后再划线接种于血液琼脂平板和脑心浸出液培养基,37培养1824h后观察。在血液琼脂平板上应生长出湿润无色透明边缘整齐的光滑型菌落。菌落周围有明显的-溶血环,直径约5.0mm;在脑心浸出液培养基上为灰白色光滑菌落。 1.2细菌形态观察 挑取血琼脂平板中的单个菌落涂片、革兰氏染色、镜检,观察细菌的形态,结果应为革兰阳性链球菌。 链球菌分离培养和涂片镜检参考图片: 图A.1 分离菌在脑心浸出液培养 图A.2 分离菌在血琼脂培养基上生长状态 图A.3 镜检下
16、分离菌形态结构 DB21/T 30952018 6 1.3生化试验 分离菌经24h鲜血琼脂平板纯培养后,进行糖发酵试验和其他生化试验,结果应如表A.1中所列。 表A.1 链球菌的生化反应结果 项目 结果 项目 结果 项目 结果 V-P试验 - 山梨醇 + 甜醇 - 6.5%NaCl - 阿拉伯糖 - 半乳糖 + 淀粉酶试验 + 果糖 + 棉籽糖 - 葡萄糖 + 肌醇 - 菊糖 - 蔗糖 + 木糖 - 水杨素 + 卫矛醇 - 麦芽糖 + 海藻糖 + 鼠李糖 - 乳糖 + 柳醇 + 2.分子生物学鉴定 2.1 应用16SrRNA基因序列分析法鉴定细菌,首先合成用于扩增细菌16SrRNA基因序列的通
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