王昕医械内毒素初菌实验.ppt
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1、山东省医疗器械产品质量检验中心山东省医疗器械产品质量检验中心医疗器械细菌内毒素检查法无菌医疗器械细菌内毒素检验无菌医疗器械细菌内毒素检验王昕王昕2017.10山东省医疗器械产品质量检验中心山东省医疗器械产品质量检验中心热原及内毒素热原及内毒素定义来源热原任何可以引起发热的物质。热原任何可以引起发热的物质。热原可分为两类:微生物热原(如,可分为两类:微生物热原(如,细菌、真菌、病毒)和非微生物细菌、真菌、病毒)和非微生物热原(如,药物、器械材料、类热原(如,药物、器械材料、类固醇、血浆制品等)固醇、血浆制品等)已发现的热原大多数为革兰氏阴已发现的热原大多数为革兰氏阴性细菌的内毒素。虽然革兰氏阳性
2、细菌的内毒素。虽然革兰氏阳性细菌、真菌和病毒可能致热原,性细菌、真菌和病毒可能致热原,但它们的致热机理不同(系统作但它们的致热机理不同(系统作用)并且作用程度低于革兰氏阴用)并且作用程度低于革兰氏阴性细菌。本课件只包括革兰氏阴性细菌。本课件只包括革兰氏阴性细菌内毒素试验。不适用于细性细菌内毒素试验。不适用于细菌内毒素以外热原的评价。菌内毒素以外热原的评价。内毒素革兰氏阴性细菌细胞外壁的高分革兰氏阴性细菌细胞外壁的高分子量脂多糖(子量脂多糖(LPS)成分,如感)成分,如感染人体血液或组织,内毒素可导染人体血液或组织,内毒素可导致发热、脑膜炎和血压迅速降低致发热、脑膜炎和血压迅速降低等。等。当革兰
3、氏阴性细菌分解或裂解时,当革兰氏阴性细菌分解或裂解时,主要由蛋白、磷脂和脂多糖组成主要由蛋白、磷脂和脂多糖组成的细菌外壁成份不断释放入环境的细菌外壁成份不断释放入环境中。内毒素污染难以预防,因为中。内毒素污染难以预防,因为其广泛存在于自然界中、性质稳其广泛存在于自然界中、性质稳定并且体积较小可通过常规的除定并且体积较小可通过常规的除菌滤膜。菌滤膜。山东省医疗器械产品质量检验中心山东省医疗器械产品质量检验中心细菌内毒素试验细菌内毒素试验v本法系利用鲎试剂(本法系利用鲎试剂(LALLAL)来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素)来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素,以判断供试品中细菌内毒以判
4、断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法素的限量是否符合规定的一种方法.细菌内毒素国家标准品细菌内毒素国家标准品自大肠埃希菌提取精制而成.用于标定复核仲裁鲎试剂灵敏度,标定细菌内毒素工作标准品的效价.干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备,凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验,光度测定法中标准曲线可靠性试验.细菌内毒素工作标准品细菌内毒素工作标准品以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价用于标定复核仲裁鲎试剂灵敏度,标定细菌内毒素工作标准品的效价.干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备,凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验,光度测定法中标准曲线可靠性试验.细菌内毒素国家标准品细菌内毒素国家标准品自大肠埃
5、希菌提取精制而成.用于标定复核仲裁鲎试剂灵敏度,标定细菌内毒素工作标准品的效价.干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备,凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验,光度测定法中标准曲线可靠性试验.细菌内毒素国家标准品细菌内毒素国家标准品自大肠埃希菌提取精制而成.用于标定复核仲裁鲎试剂灵敏度,标定细菌内毒素工作标准品的效价.干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备,凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验,光度测定法中标准曲线可靠性试验.细菌内毒素国家标准品细菌内毒素国家标准品自大肠埃希菌提取精制而成.用于标定复核仲裁鲎试剂灵敏度,标定细菌内毒素工作标准品的效价.干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备,凝胶法中鲎试剂灵敏度
6、复核试验,光度测定法中标准曲线可靠性试验.细菌内毒素国家标准品细菌内毒素国家标准品自大肠埃希菌提取精制而成.用于标定复核仲裁鲎试剂灵敏度,标定细菌内毒素工作标准品的效价.干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备,凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验,光度测定法中标准曲线可靠性试验.细菌内毒素国家标准品细菌内毒素国家标准品自大肠埃希菌提取精制而成.用于标定复核仲裁鲎试剂灵敏度,标定细菌内毒素工作标准品的效价.干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备,凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验,光度测定法中标准曲线可靠性试验.山东省医疗器械产品质量检验中心山东省医疗器械产品质量检验中心内毒素单位endotoxin unit
7、(EU)v内毒素活性测定的标准单位,最初建立的活性相内毒素活性测定的标准单位,最初建立的活性相当于当于0.2ng的美国参照内毒素,批号的美国参照内毒素,批号EC-2(美(美国药典标准参照材料)。国药典标准参照材料)。v 注:注:FDA参照内毒素参照内毒素EC-6、美国药典批、美国药典批G和世界卫生组织的国际基准内毒素标准品和世界卫生组织的国际基准内毒素标准品(IS)都都是从同一内毒素批中分出来的,使是从同一内毒素批中分出来的,使EU和和IU相等相等(Poole et al.,1997)。)。山东省医疗器械产品质量检验中心山东省医疗器械产品质量检验中心细菌内毒素检查用水及器皿要求细菌内毒素检查用
8、水及器皿要求v细菌内毒素检查用水指内毒素含量小于0.015EU/ml(用于凝胶法)或小于0.005EU/ml(用于光度测定法)且对细菌内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水.v试验所用器皿需经处理,以去除可能存在的外源性内毒素.耐热器皿常用干热灭菌法(250,30分钟以上)去除,也可采用其它确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法.若使用塑料器械,如微孔板和与微量加样器配套的吸头等,应选用标明无内毒素且对试验无干扰的器械.山东省医疗器械产品质量检验中心山东省医疗器械产品质量检验中心定义和术语定义和术语非致热性的非致热性的non-pyrogenic 描述医疗产品不产生发热反应描述医疗产品不产生发热反应的术
9、语。的术语。注:也可用于描述和医疗产品注:也可用于描述和医疗产品的内毒素水平低于规定的限值。的内毒素水平低于规定的限值。非致热性的非致热性的non-pyrogenic 描述医疗产品不产生发热反应描述医疗产品不产生发热反应的术语。的术语。注:也可用于描述和医疗产品注:也可用于描述和医疗产品的内毒素水平低于规定的限值。的内毒素水平低于规定的限值。非致热性的非致热性的non-pyrogenic 描述医疗产品不产生发热反应描述医疗产品不产生发热反应的术语。的术语。注:也可用于描述医疗产品的注:也可用于描述医疗产品的内毒素水平低于规定的限值。内毒素水平低于规定的限值。产品内毒素限值产品内毒素限值prod
10、uct product endotoxin limitendotoxin limit规定的某一产品内毒素规定的某一产品内毒素的最大可接受水平。的最大可接受水平。山东省医疗器械产品质量检验中心山东省医疗器械产品质量检验中心定义和术语定义和术语增强 enhancement 非内毒素相关因素(通常由试验样品的非内毒素相关因素(通常由试验样品的特性所致)导致的细菌内毒素试验异常特性所致)导致的细菌内毒素试验异常现象,使试验反应高于实际存在的内毒现象,使试验反应高于实际存在的内毒素总量。素总量。非内毒素相关因素(通常由试验样品的非内毒素相关因素(通常由试验样品的特性所致)导致的细菌内毒素试验异常特性所致
11、)导致的细菌内毒素试验异常现象,使试验反应低于实际存在的内毒现象,使试验反应低于实际存在的内毒素总量。素总量。抑制抑制 inhibition抑制抑制/增强试验增强试验inhibition/enhancement testinhibition/enhancement test用于确定某一特定细菌内毒素试验样品用于确定某一特定细菌内毒素试验样品是否含有减小试验准确性的因素是否含有减小试验准确性的因素,即是否即是否对试验系统产生抑制或增强作用的试验对试验系统产生抑制或增强作用的试验山东省医疗器械产品质量检验中心山东省医疗器械产品质量检验中心定义和术语定义和术语最大有效稀释倍数(MVD)是指在试验中供
12、试品溶液被允许达到稀释的最大倍是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数数,在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测检测.鲎试剂鲎试剂LAL 反应材料反应材料(LAL reactive material(LAL-RM)任何激活鲎试剂任何激活鲎试剂LAL并引起增强的非内毒素成分并引起增强的非内毒素成分灵敏度灵敏度lambda()鲎试剂鲎试剂LAL凝胶试剂的标称灵敏度,以凝胶试剂的标称灵敏度,以EU/mL表表示。或,对于显色法和浊度法,为参照标准曲线示。或,对于显色法和浊度法,为参照标准曲线的最低点(内毒素浓度)。的最低点(内毒素浓度)。山东省医
13、疗器械产品质量检验中心山东省医疗器械产品质量检验中心定义和术语定义和术语鲎氏剂鲎氏剂(LAL)从鲎(从鲎(horseshoe crab)美国鲎(美国鲎(Limulus polyphemus)或中国鲎()或中国鲎(Tachypleus tridentatus)的的循环血变形细胞中提取的试剂,与内毒素相互反应产循环血变形细胞中提取的试剂,与内毒素相互反应产生凝胶,用于细菌内毒素试验测定细菌内毒素水平。生凝胶,用于细菌内毒素试验测定细菌内毒素水平。试验内毒素限值试验内毒素限值test endotoxin limit浸提液中所允许的最大内毒素浓度,该确定的限值用于浸提液中所允许的最大内毒素浓度,该确定
14、的限值用于计算样品浸提(多个单位和一个单元)的最大有效稀释倍计算样品浸提(多个单位和一个单元)的最大有效稀释倍数数 鲎氏剂鲎氏剂(LAL)从鲎(从鲎(horseshoe crab)美国鲎(美国鲎(Limulus polyphemus)或中国鲎()或中国鲎(Tachypleus tridentatus)的的循环血变形细胞中提取的试剂,与内毒素相互反应产循环血变形细胞中提取的试剂,与内毒素相互反应产生凝胶,用于细菌内毒素试验测定细菌内毒素水平。生凝胶,用于细菌内毒素试验测定细菌内毒素水平。试验内毒素限值试验内毒素限值test endotoxin limit浸提液中所允许的最大内毒素浓度,该确定的限
15、值用于浸提液中所允许的最大内毒素浓度,该确定的限值用于计算样品浸提(多个单位和一个单元)的最大有效稀释倍计算样品浸提(多个单位和一个单元)的最大有效稀释倍数数 山东省医疗器械产品质量检验中心山东省医疗器械产品质量检验中心需控制内毒素的医疗器械需控制内毒素的医疗器械 直接或间接与血管内、淋巴内或鞘内接触的产品,或是可能与类似系统接触的产品(如输液器、输移器、导管、植入物和输液组件)、或是眼内使用的眼科产品(如硅油、黏弹性产品、眼内透镜)应评价内毒素。满足内毒素要求的产品可给出声称非致热性的标签。注:国外产品通常不标示无热原,因为无热原意味着绝对不含细菌内毒 素。而所有BET方法的固有检出限都无法
16、使试验证实绝对不含有 细菌内毒素。山东省医疗器械产品质量检验中心山东省医疗器械产品质量检验中心检验实验室当前有三种细菌内毒检验实验室当前有三种细菌内毒素检验技术可供选择。每一技术素检验技术可供选择。每一技术的选择宜建立在实验室技能、经的选择宜建立在实验室技能、经验、样品量要求、数据处置要求验、样品量要求、数据处置要求和试验样品性质之上的充分评定。和试验样品性质之上的充分评定。当前技术和方法包括当前技术和方法包括当前技术和方法当前技术和方法凝胶技术:限值试验和测定方法;凝胶技术:限值试验和测定方法;显色技术:动力学和终点方法;显色技术:动力学和终点方法;浊度技术:动力学和终点方法浊度技术:动力学
17、和终点方法山东省医疗器械产品质量检验中心山东省医疗器械产品质量检验中心将试验样品稀释至将试验样品稀释至确认过的浓度确认过的浓度在在10mm75mm玻璃试管内与鲎玻璃试管内与鲎试剂等体积混合试剂等体积混合不能保持完整不能保持完整者为阴性试验者为阴性试验凝胶坚实并保持凝胶坚实并保持完整者为阳性试验完整者为阳性试验当前技术和方法当前技术和方法 凝胶技术凝胶技术限值试验和分析方法限值试验和分析方法孵育后将各孵育后将各试管从孵育试管从孵育器中小心地器中小心地取出,缓慢取出,缓慢倒转倒转180凝胶法无论是在所需进行确认分析的技术技能方面,还是在数据解释/分析方面,都是最简便的BET技术。设备投资很小,仅需
18、一台适宜的鉴定的维护的和性能合格的水浴箱或加热器(heating block)及辅件。山东省医疗器械产品质量检验中心山东省医疗器械产品质量检验中心当前技术和方法当前技术和方法 显色和浊度技术显色和浊度技术终点方法终点方法原理基于内毒素浓度和产色(显色)或浊度之间的线性关系,显色或浊度是通过给定波长(在相对小的标准系列稀释液范围内被评价)下测量光密度来测量。通过测定用细菌内毒素检查用水(用于光度测定法)制备的内毒素标准系列稀释液的光密度,绘制出内毒素浓度标准曲线。进行线性回归分析,形成的“最适宜”的标准曲线覆盖约1个log内毒素范围,一般为1.0 EU/mL0.1 EU/mL或0.1 EU/mL
19、0.01 EU/mL。相关系数是所观察的各点相对离开回归线的统计学测量,线性被定义为相关系数的绝对值0.980。通过测定样品的光密度并插入标准曲线,计算出未知的内毒素水平。终点法一般使用酶标板,还需要一台加热器和一台经鉴定的酶标仪,酶标仪配有建立标准曲线和样品分析的统计学软件包(线性回归分析)。显色和浊度方法与凝胶试验相比要更多地依赖于良好的分析技术,在分析和解释数据时要应用统计学知识。山东省医疗器械产品质量检验中心山东省医疗器械产品质量检验中心当前技术和方法当前技术和方法 显色和浊度技术显色和浊度技术动力学方法动力学方法原理测定系列标准稀释液到达预先确定的光密度程度(动力学浊度)或显色程度(
20、动力学显色)所耗用的时间量,有时称为启动OD(onset OD)或反应OD(reaction OD)。通过绘制启动或反应时间(即每一标准或样品达到启动OD的所耗用的时间)的log值与内毒素浓度的log值有函数关系,建立标准曲线。该数据经log/log处理的建立了一条线性标准曲线。为动力学分析所建的曲线范围可高达4个log,而终点分析的所建曲线范围只有1个log,除非使用其他经批准回归分析方法(目前FDA受权的都是基于一家生产商的试剂),用横跨各观察点的线性回归分析来建立标准曲线,动力学方法最小线性要求为相关系数 0.980。与终点方法一样,可将样品的onset时间的对数值插入从标准曲线被计算出
21、未知的细菌内毒素含量。动力学方法可使用酶标板、玻璃管或其他确认过的技术。这些方法都需经确认的读取结果的设备并配备建立标准曲线和样品分析的统计学软件包(回归分析)。在这些方法专用电子表格或数据基础软件包的使用,可极大地便利数据的即时分析和走势分析。与终点方法一样,证实一个好的、恒定的实验,实验室技术主要取决于分析人员,在分析和解释数据时还要用到基础统计学知识。山东省医疗器械产品质量检验中心山东省医疗器械产品质量检验中心资料介绍资料介绍-确定产品内毒素限值确定产品内毒素限值USP34中规定的医疗器械的内毒素限值对于医疗器械而言,每件器械内毒素限值不超过20.0 USP EU。然而,与脑脊液接触器械
22、的内毒素限值为每件器械不超过2.15 USP EU。FDA指南(1987)中规定的医疗器械的内毒素限值器械内毒素限值为0.5 EU/mL,与脑脊液接触器械的内毒素限值为0.06 EU/mL。内内毒毒素素限限值值这些限值是建立在每件器械这些限值是建立在每件器械40mL40mL冲洗液的基础之上。对于与病人接触冲洗液的基础之上。对于与病人接触表面积特别小或大型器械,可使用一个调节因子来选择冲洗或浸提体表面积特别小或大型器械,可使用一个调节因子来选择冲洗或浸提体积。内毒素限值可相应调整。积。内毒素限值可相应调整。注意:注意:山东省医疗器械产品质量检验中心山东省医疗器械产品质量检验中心资料介绍资料介绍-
23、确定产品内毒素限值确定产品内毒素限值成套器械成套器械成套器械被定义为在一个初包装内多组件的集合,成套器械在使用地点装配成医疗产品。在这种情况下规定的内毒素限值是针对组装后器械的,而非各组件的内毒素限值(见表1)。当检验一个成套器械的分组件时,可以使用混合的浸提液,前提是要保留各成套器械浸提液的比例。比如,某一器械可能有3个组件,各组件所用的浸提液总体积应不超过MVD。这可以用一份浸提液对所有3个组件浸提,也可将三个组件各用一部分液体分别浸提然后混合,还可将这两种方法组合起来。当组合后样品出现结果不确定时,就需要分别检验各组件,以研究各组件的污染源。器械包器械包器械包被定义为在一个初包装内或各种
24、医疗器械过程中多个医疗产品的集合。各器械可以有各自的产品内毒素限值,且宜分别进行试验和评价(见表1)。山东省医疗器械产品质量检验中心山东省医疗器械产品质量检验中心产品单元检验项目基于非致热性声称说明a)初包装中独立初包装中独立的医的医疗疗器械器械 独立医独立医疗疗器械器械独立医独立医疗疗器械器械各医各医疗疗器械在器械在临临床床应应用中用中独立使用独立使用b)初包装中成套初包装中成套组组件件组组件的件的组组合合组组件的件的组组合合在在临临床床应应用中用中组组件被装配件被装配成一套成一套产产品并一起使用。品并一起使用。c)初包装中若干初包装中若干相同的医相同的医疗疗器器械械取自初包装的取自初包装的
25、单单一一医医疗疗器械器械取自初包装的取自初包装的单单一医一医疗疗器械器械在在临临床床应应用中各医用中各医疗疗器械器械独立使用独立使用d)医医疗过疗过程相关程相关的含多个器械的含多个器械包包声称无致声称无致热热性的每性的每种医种医疗疗器械器械声称无致声称无致热热性的每种性的每种医医疗疗器械器械 在在临临床床应应用中每种医用中每种医疗疗器械独立使用,可有不器械独立使用,可有不同的同的产产品内毒素限品内毒素限值值 表表1 检验产品单元的选择检验产品单元的选择资料介绍资料介绍-确定产品内毒素限值确定产品内毒素限值山东省医疗器械产品质量检验中心山东省医疗器械产品质量检验中心供试品溶液的制备供试品溶液的制
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