DB62∕T 4634-2022 牛结节性皮肤病血清学诊断技术(甘肃省).pdf
《DB62∕T 4634-2022 牛结节性皮肤病血清学诊断技术(甘肃省).pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《DB62∕T 4634-2022 牛结节性皮肤病血清学诊断技术(甘肃省).pdf(11页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、ICS 11.220 CCS B 41 62 甘肃省h巴TA 方析、准0862/T 4634-2022 牛结节性皮肤病血清学诊断技术Serodiagnostic technology for lumpy skin disease 2022 -09 -16发布2022 -10 -20实施甘肃省市场监督管理局发布牛结节性皮肤病血清学诊断技术范围本文件规定了牛结节性皮肤病的血清学诊断方法及其综合判定。本文件适用于牛结节性皮肤病的快速诊断、检疫和流行病学调查。2 规范性引用文件0862/T 4634-2022 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该
2、日期对应的版本适用于本关件;不注日期的引用文件,其最新版炼U包括所有的修改单)适用于本文件。GB 19489 实验室生物安全通用要求GB/T 39602 牛结节性皮肤病诊断技术NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存和运输技术规范3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1 牛结节性皮肤病Jumpyskmdmse(LSD)又名牛疙瘩皮肤痛,是由症病毒科脊椎动物亚科山羊症病毒属的牛结节性皮肤病病毒(LSDV)感染牛引起的种气染病主要由吸血节肢动物传播,其|脂床特征主要为发热,皮肤、数膜和内脏器官表面的广泛性结节,淋巴结肿大,动物消瘦,产奶量降低,不孕、不育和流产,以及无症状的隐性损伤和继发
3、感染等表现。4 样品采集与生物去全管理LSDI自床病例检查与剖检,诊断检测样品的采集、运输和处理按照GB/T39602和NY/T541执行;实负(验室血清学试验以及待检样品、培养物和废弃物处理中的生物安全管理均按GB19489的相关规定执行。5 病毒中和试验CVNT)5. 1 材料MEM培养液,绵羊羔辜丸细胞(LTc), MDBK细胞,LSDV抗原及标准阳性、阴性血清,待检血i肯。5. 2 方法5.2. 1 样品处理1 0862/T 4634-2022 将待检血i育,包括标准阳性血清、阴性血请各l份,用E咯les!HEPES液5倍稀释,56C土0.5C灭活30mm后备用。5. 2. 2 标准毒
4、株与处理将loglO6 TCID,o/mL的山羊症病毒属病毒参考毒株或LSDV标准毒株在小瓶中用E咯les!HEPES液进行系列稀释,毒价分别为loglO5.0 TCIDso/mL、loglO4.0 TCIDso/mL、loglO3.5 TCIDso/mL、loglO3.0 TCIDso/mL、loglO 2.5 TCID,o/mL、loglO2.0 TCID,o/mL和loglO1.5 TCID,o/mL。5. 2. 3 加血清与病毒5.2.3. 1 将第l份灭活的待检血清50L分别加到微量j商定板A到H行的第l、第2列孔中,第2份血清加到第二第4列孔中,第3份血清加到J第三第6列孔中,第4
5、份血清加到第7、第8列孔中,阴性对照血清加到第9、第10列孔中,50L不含血清的Eagles!HEPES液分别加到第11、第12列以及H行的所有孔中。5. 2. 3. 2 从G行开始用最大稀释度的病毒液50L.加到该行的每个孔中。依此将每个稀释度的病毒加入到相应行的各孔中,直到最小病毒稀释物加到UA 行。5.2.4 感作中和摇匀后,微量;商定板加盖,置3TC土0.5C温箱中,中和孵育lh,期间每15min振摇l次。5. 2. 5 细胞感染取生长良好的单层MDBK细胞或LTc1瓶,按常规方法消化,用Eagles培养基调整细胞浓度至105个/mL.将lL细胞悬液加到除培养基对照孔Hll和H12以外
6、的所有孔中,H行的其余孔作为细胞和血清对照。接种后,微量j商定板加盖,置3TC土0.5C、5%CO,培养箱条件下培养。5. 2. 6 细胞病变观察从培养第3d开始,在倒置显微镜下每天观察单层细胞的细胞病变效应CCPE)情况,直至第判,H行细胞应无CPE。以待检血清最高稀释度50%保护为该待检lIl育中和效价,以能保护细胞免受感染的最高稀释度为该血洁的抗体滴度。5. 3 结果判定用Krber方法计算病毒中和指数,即病毒在标准阴性血洁和待检血清间的log商度差。若指数去1.5表示为LSDV阳性。6 Western-blot试验6. 1 材料6. 1. 1 浓缩胶:由5%聚丙股股Tris(125mM
7、, pH 6.8)和SDS(0.1 %)组成,6. 1. 2 分离胶:由1O%12.5%聚丙眈胶Tris(560mM, pH 8.7)和SDS(O.1%)组成;6. 1. 3 甘氨酸电泳缓冲液250mMTris、2M甘氨酸和O.I%SDS;6. 1. 4 封闭液3%BSA;f日0.05%Tween 20 PBS,或5%奶粉和0.05%Tween 20 PBS; 6. 1. 5 二氨基联苯胶盐酸盐i自液(在50mL50mm Tris!HCl pH 7.5中加10mg二氨基联苯胶和20L30%v/v过氧化氢);2 0862/T 4634-2022 6. 1.6 标准蛋白分子质量marker,硝酸纤
8、维素膜(NCM),病毒粒子抗原或重组蛋白抗原。6. 2 方法6.2. 1 样品处理将待检血清,包括阳性血清、阴性血清各l份,用封闭液1,50稀释血清,560土0.50灭活30min后备用。6.2.2 抗原制备当山羊症病毒属病毒感染LT的CPE达到90%时收获细胞,冻融三次,离心,取上请转移到个新.气管,力日病毒裂解液煮沸5min,作为组i只培养的病毒粒子抗原。也可用情外表达的重组蛋白代替病毒粒子抗原。6.2.3 SDS!PAGE分析6.2.3. 1 将制备的病毒粒子抗原或重组蛋白抗原与标准蛋白分子质量mark泣同时分别上样,加到SDS!PAGE凝胶孔中,在甘氨酸电泳缓忡液中分离蛋白。6.2.3
9、.2将SDS!PAGE凝胶上分离的蛋白电转移到张硝酸纤维素膜(NOM)上,转移后的NCM用PBS充分冲洗,并用3%牛lIl青白蛋白PBS或5%脱脂奶粉PBS在旋转振荡器上40土050封闭过夜。6.2.4 杂交将NCM按组El剪成数个纸条,用PBS在旋转振荡器上彻底冲洗册,每次飞mm;然后分别放在相应的血清(包括阳性和阴性对照lIl肯)中在室温下震荡l元,再次充分洗涤NCM,并孵育在特定稀释的辣根过氧化酶结合的抗牛免疫球蛋白IgG中,一在室温中进步孵育l元。6.2.5 显色将杂交后的时GM冲洗后,加二氨基联苯胶盐酸盐i窑液和20L30% v/v过氧化氢,然后在室温下震荡孵育3min7mtn,在N
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- DB62T 4634-2022 牛结节性皮肤病血清学诊断技术甘肃省 DB62 4634 2022 结节 皮肤病 血清学 诊断 技术 甘肃省
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【曲****】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【曲****】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。