DB34∕T 3307-2018 分子标记辅助选择抗稻瘟病基因Pi1、Pi2的检测 PCR法(安徽省).pdf
《DB34∕T 3307-2018 分子标记辅助选择抗稻瘟病基因Pi1、Pi2的检测 PCR法(安徽省).pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《DB34∕T 3307-2018 分子标记辅助选择抗稻瘟病基因Pi1、Pi2的检测 PCR法(安徽省).pdf(12页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、ICS 65.020.99 B 21 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 33072018 分子标记辅助选择抗稻瘟病基因Pi1、Pi2的检测 PCR 法 Protocol for molecular marker assisted-selection of rice blast resistance gene Pi1 and Pi2 PCR method 文稿版次选择 2018 - 12 - 29 发布 2019 - 01 - 29 实施安徽省市场监督管理局 发 布 DB34/T 33072018 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省种子质
2、量监督检验站提出。 本标准由安徽省动植物检验检疫标准化委员会归口。 本标准起草单位: 安徽省种子质量监督检验站、 合肥丰乐种业股份有限公司、 安徽省种子管理总站、安徽出入境检验检疫局技术中心。 本标准主要起草人:周桂林、胡晓玲、吴晓亮、张文晓、周锐、周贤达、曹玉洁、范家萌、徐丽媛、周红英、王凤杰、胡娜、宗凯、张奇、王兆贤、刘根、熊成国、王浩波。 DB34/T 33072018 1 分子标记辅助选择抗稻瘟病基因Pi1、Pi2的检测 PCR 法 1 范围 本标准规定了分子标记辅助选择抗稻瘟病双基因 Pi1 和 Pi2 的 PCR 检测方法。 本标准适用于抗稻瘟病分子标记辅助育种,以及水稻品种中稻瘟
3、病抗源基因的分子鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件, 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp:base pair,碱基对 CTAB:cetyltrimethyl ammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵 DNA:deoxyribonucleic acid,脱氧核糖核酸 dNTPs:deoxyribonucleoside triphosphates,脱氧核苷三磷酸 PAGE:p
4、olyacrylamide gelelectrophoresis,聚丙烯酰胺凝胶电泳 PCR:polymerase chain reaction,聚合酶链式反应 SSR:simple sequence repeat,简单序列重复 Taq 酶:Taq-DNA polymerase,耐热 DNA 聚合酶 ddH2O:双蒸水(超纯水) 4 原理 根据水稻抗稻瘟病基因 Pi1、Pi2 在染色体上的位置和保守区序列, 分别筛选两套特异性检测引物,包括适用于抗稻瘟病分子标记辅助育种和水稻品种中稻瘟病抗源基因初步鉴定的、 与抗稻瘟病基因 Pi1和 Pi2 紧密连锁的分子标记,以及适用于对连锁标记检测结果进行
5、验证和水稻品种中稻瘟病抗源基因精确鉴定的、 位于抗稻瘟病基因 Pi1 和 Pi2 序列内的特异性检测标记。 提取不同水稻品种或育种群体的 DNA,利用筛选的特异性检测引物对样品 DNA 进行 PCR 扩增,依据是否扩增获得预期大小的 DNA片段来判断样品是否携带该抗稻瘟病基因及其等位基因型。 5 仪器设备 DB34/T 33072018 2 高压灭菌锅、超纯水仪、高速离心机、恒温水浴锅(30100)、核酸蛋白测定仪、组织研磨仪、PCR 扩增仪、高压电泳仪、垂直电泳槽及制胶附件、微量可调加样器(2 L、10 L、100 L、1000 L)。 6 试剂和溶液配制 所用试剂均为分析纯,试剂配制的用水
6、应符合 GB/T 6682 规定的一级水的要求。 6.1 试剂 6.1.1 DNA 提取试剂 十六烷基三甲基溴化铵、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙二胺四乙酸二钠、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、氢氧化钠、氯化钠。 6.1.2 PCR 扩增试剂 引物、DNA、dNTPs、Taq 酶、10Buffer 缓冲液、ddH2O、和 Mg2+ 或者 Mix 反应混合液。 6.1.3 PAGE 电泳试剂 去离子甲酰胺、溴酚蓝、二甲苯青 FF、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、硼酸、尿素、亲和硅烷、剥离硅烷、DNA 分子量标准、无水乙醇、四甲基乙二胺、过硫酸铵、冰醋酸、硝酸银、甲醛、氢氧化钠。 6.2 溶液配制 见附录A。 7
7、 实验步骤 7.1 DNA 提取 7.1.1 CTAB 法 取待检样品的去壳种子、幼苗或叶片约 200300 mg 置于 2.0 mL 离心管,充分研磨;每管加入700 L 经 65预热的 CTAB 提取液,充分混合,65水浴 30 min,期间多次颠倒混匀;每管加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)混合液,充分混合后静置 10 min;10000 g 离心 10 min,吸取上清液 300 L 转移至一新管,加入 600 L 预冷 95乙醇,颠倒混匀,-20冷冻 30 min;10000 g 离心 10 min,弃上清液,用 70乙醇溶液洗涤 2 遍;室温自然晾干后,加入超纯水或 TE 缓冲液
8、 400 L,充分溶解;检测浓度后备用。 7.1.2 碱煮法 将种子发芽至幼苗长度达到 3 cm 左右时剪取 0.5 cm 长的幼苗,或将田间植株的叶片剪取 0.5 cm0.5 cm 大小,放入 96 孔深孔板中。每孔加入 40 L 氢氧化钠提取液,沸水加热 1 min,然后加入 60 L TE 缓冲液,沸水加热 2 min。放在 4冰箱备用。 7.2 PCR 扩增 7.2.1 筛选引物 DB34/T 33072018 3 本标准针对抗稻瘟病基因 Pi1 和 Pi2 分别筛选出两对检测引物(见表1),包括与抗稻瘟病基因 Pi1 和 Pi2 紧密连锁的分子标记 P1-1 和 P2-1, 适用于抗
9、稻瘟病分子标记辅助育种和水稻品种中稻瘟病抗源基因的初步鉴定; 以及位于抗稻瘟病基因 Pi1 和 Pi2 序列内的特异性检测标记 P1-2 和 P2-2,适用于水稻品种中稻瘟病抗源基因的精确鉴定,或对引物 P1-1 和 P2-1 的鉴定结果进行验证。 表1 检测抗稻瘟病基因Pi1和Pi2的引物序列和扩增产物片段大小 基因名称 引物编号 引物序列 抗性基因扩增产物片段大小 (bp) Pi1 P1-1 F: ATTGCTGCAAAGTGGGAGAC 94 R: AAGTGGAGGCAGTTCACCAC P1-2 F:GTGCTGCTGTGGCTA GTTTG 460 R: AGTCCCCGCTCAA
10、TTTTTCT Pi2 P2-1 F: GTGCATGAGTCCAGCTCAAA 143 R: GTGTACTCCCATGGCTGCTC P2-2 F:TGATTATGTTTTTTATGTGGGG 111 R: ATTAGTGAGATCCATTGTTCC 7.2.2 连锁标记两重 PCR 反应体系 反应体系的总体积和组分的终浓度按照附录B 进行配量, 可以依据试验条件不同作相应调整。 缓冲液若含有 MgCl2,不再加 MgCl2 溶液,加等体积无菌水替代。 7.2.3 特异标记 PCR 反应体系 反应体系的总体积和组分的终浓度按照附录B 进行配量, 可以依据试验条件不同作相应调整。 缓冲液若含
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- DB34T 3307-2018 分子标记辅助选择抗稻瘟病基因Pi1、Pi2的检测 PCR法安徽省 DB34 3307 2018 分子 标记 辅助 选择 稻瘟病 基因 Pi1 Pi2 检测 PCR
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【曲****】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【曲****】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。
链接地址:https://www.zixin.com.cn/doc/159128.html