DB37∕T 3374-2018 玉米粗缩病病原检测技术规程(山东省).pdf
《DB37∕T 3374-2018 玉米粗缩病病原检测技术规程(山东省).pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《DB37∕T 3374-2018 玉米粗缩病病原检测技术规程(山东省).pdf(11页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、ICS 65.020 B 01 DB37 山东省地方标准 DB 37/T 33742018 玉米粗缩病病原检测技术规程 Technical regulation for pathogen detection of maize rough dwarf disease 2018 - 07 - 19 发布 2018 - 08 - 19 实施 山东省质量技术监督局 发 布 DB37/T 33742018 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山东省农业厅提出。 本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位:山东省农业科学院植物保护研究所。 本标准主要
2、起草人:姜珊珊、辛相启、王升吉、吴斌、张眉、辛志梅。 DB37/T 33742018 1 玉米粗缩病病原检测技术规程 1 范围 本标准规定了玉米粗缩病主要病原水稻黑条矮缩病毒的间接ELISA、 Dot-ELISA和普通RT-PCR检测方法。 本标准适用于山东省玉米粗缩病病原水稻黑条矮缩病毒在传播介体灰飞虱和玉米中的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件, 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14926.50 实验动物 酶联
3、免疫吸附试验 SN/T 1193 基因检验实验室技术要求 SN/T 2964 植物病毒检测规范 SN/T 1666 水稻条纹病毒、水稻矮缩病毒、水稻黑条矮缩病毒的检测方法 普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 玉米粗缩病 Maize rough dwarf disease,MRDD 一种爆发流行性病毒病害, 在山东其主要病原为水稻黑条矮缩病毒。 玉米感染粗缩病后, 节间粗短、生长迟缓、病株矮化;叶背、叶鞘上出现粗细不等的蜡白色条状突起;心叶不易抽出且变小,叶片宽短僵直,叶色浓绿,顶部叶片簇生;雄穗、雌穗发育不良,畸形不实或籽粒减少
4、,严重影响玉米的产量。 3.2 水稻黑条矮缩病毒 Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV 呼肠孤病毒科(Reoviridae),斐济病毒属(Fijivirus),病毒粒子、传播途径及危害:病毒粒体球状,直径70 nm75 nm,具有双层外壳蛋白, 病毒基因组由10片段双链RNA组成,在自然界中以灰飞虱传毒为主,导致寄主植物矮化、沿叶脉瘤肿等症状,主要侵染禾本科植物。 3.3 灰飞虱 Small Brown Planthopper,SBPH DB37/T 33742018 2 拉丁名为Laodelphax striatellus,属同翅目,飞虱科,寄主植物主要
5、有水稻、小麦、玉米、高粱、禾本科杂草等禾本科植物,是水稻黑条矮缩病毒的主要传播介体,以持久性不经卵方式传播病毒,1代成虫发生量与带毒率是影响玉米粗缩病发生流行的关键因素。 3.4 酶联免疫吸附测定 enzyme linked immunosorbent assay,ELISA 具体描述参照GB/T 14926.50。 3.5 间接酶联免疫吸附测定 indirect enzyme linked immunosorbent assay,IELISA 简称IELISA,首先用样品中抗原包被于固相载体,经洗涤,加入相应病毒的抗体,形成待测抗原-抗体复合物,再经孵育洗涤后,加入酶标记二抗,形成固相抗原-
6、抗体-酶标二抗复合物,测定加底物后的显色程度,确定待测抗体含量。 3.6 斑点酶联免疫吸附测定 dot enzyme linked immunosorbent assay,Dot-ELISA 以纤维素膜代替免疫酶固相载体法中常用的聚苯乙烯微量反应板而建立的一种免疫检验方法。 不仅保留了常规ELISA的优点,而且还弥补了抗原或抗体对载体包被不牢等不足,所以具有敏感性高,特异性强, 被检样品用量少, 节省材料, 不需特殊仪器, 结果判定简单易行和便于长期保存等特点。 Dot-ELISA的基本原理与常规ELISA基本相同,即将抗原或抗体首先吸附在纤维素薄膜(如硝酸纤维素膜)表面,并保持其免疫活性,
7、通过与相应的抗体或抗原和酶标记物的一系列免疫反应, 形成酶标记抗原抗体复合物,在底物的参与下,结合物上的酶催化底物使其水解、氧化成另一种带色物质,沉着于抗原抗体复合物吸附的部位, 呈现出肉眼可见的颜色斑点。 试验的结果通过颜色斑点的出现与否和色泽深度进行判定。 3.7 逆转录-聚合酶链式反应 reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR 简称RT-PCR。具体描述参照SN/T 1666。 4 方法原理 水稻黑条矮缩病毒的血清学特性与分子生物学特性是该病毒检测方法的主要依据。RBSDV具有很强的免疫原性,同时属于RNA病毒,因此可利
8、用间接ELISA、Dot-ELISA和RT-PCR方法确定样品中是否带有该病毒。 5 主要仪器设备、用具和试剂 5.1 仪器和设备: a) 酶标仪; b) 洗板机; c) 电子天平(感量 0.001 g); d) PCR 仪; e) 电泳仪; f) 水平电泳槽; g) 凝胶成像仪; DB37/T 33742018 3 h) 高速冷冻离心机; i) 水浴锅; j) 样品冷藏柜(2 8 ); k) 低温冰箱(-20 ); l) 超低温冰箱(-80 ); m) 磁力搅拌器; n) 高压灭菌锅; o) 可调微量移液器(10 L、100 L、200 L、1000 L)。 5.2 用具: a) 无 RNa
9、se 吸头(10 L、100 L、200 L、1000 L); b) 96 孔酶标板; c) 硝酸纤维素膜(NC 膜); d) 无 RNase 离心管; e) PCR 反应管; f) 研钵; g) 样品袋; h) 标签; i) 镊子。 5.3 主要试剂 5.3.1 RBSDV 抗体、RBSDV 特异性引物、液氮、三氯甲烷、异丙醇、乙醇、M-MLV RT 反转录酶、RNA酶抑制剂、Taq DNA 聚合酶、DNA 分子标记、Gelred、琼脂糖等。 5.3.2 血清学和分子生物学检测试剂配制见附录 A。 注:除特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂。 6 样品采集与保存 6.1 在越冬代、
10、第一代灰飞虱成虫盛发初期进行灰飞虱样品采集,于稻茬麦田、旱作麦田、空茬田或田间杂草丛等灰飞虱喜好栖息环境, 采用直径 33 cm的 35 目纱网在田间随机进行扫扑, 分拣装入50 mL100 mL 试剂瓶中,100 %乙醇浸泡,-20 冰箱保存备用。 6.2 于玉米大喇叭口期至抽雄期,自矮化植株上采集具有典型蜡泪状突起的叶片或茎秆 5 g10 g,单株样品袋存放。样品采集后,在冷藏条件下(2 8 )运送至实验室。如果样品在 2 d 内检测,可暂时储存于 2 8 ;如果样品在 2 d 以后检测,保存至-80 超低温冰箱备用,样品避免反复冻融。 7 检测 7.1 间接酶联免疫吸附测定 7.1.1
11、样品制备 单头灰飞虱为1个样品,置于小型离心管内,加300 L包被缓冲液研碎,4 冰箱放置过夜;待测植株样品按1:10(质量:体积)加入包被缓冲液,用研钵研磨成浆,4 冰箱放置4 h5 h。将两类DB37/T 33742018 4 研磨液8000 r/min离心3 min,上清液即为制备好的检测样品,设阴性对照和阳性对照,阴性对照样品为未感染病毒的健康玉米植株叶片,阳性样品为感染RBSDV的玉米植株叶片,阴性样品及阳性样品皆通过RT-PCR检测及测序验证。阴性对照、阳性对照作相同的处理。样品提取缓冲液作空白对照。 7.1.2 加样 在96孔酶标板上加入制备好的待检测样品、阴性对照、阳性对照、空
12、白对照,每个样品平行加到两个孔中,每孔加样100 L,加盖,4 冰箱孵育过夜。 7.1.3 洗板 孵育结束后,用PBST清洗酶标板3次5次。每孔每次加PBST洗液700 L,每次停留1 min2 min。 7.1.4 加抗血清 用抗体稀释缓冲液按照相应病毒抗血清的使用浓度进行稀释,每孔加入稀释好的抗体液100 L,加盖,37 孵育1.5 h。 7.1.5 洗板 同7.1.3。 7.1.6 加酶标抗体 用抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度, 并加入到酶联板中, 100 L/孔, 加盖, 37孵育1.5 h。 7.1.7 洗板 同7.1.3。 7.1.8 加底物缓冲液 将现配的底物缓冲液
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- DB37T 3374-2018 玉米粗缩病病原检测技术规程山东省 DB37 3374 2018 玉米 粗缩病 病原 检测 技术规程 山东省
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【曲****】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【曲****】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。