DB37∕T 3880-2020 鸭疫里默氏杆菌病诊断技术规程.doc
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1、标准名称ICS11.220B 41DB37山东省地方标准DB37/T 38802020鸭疫里默氏杆菌病诊断技术规程Diagnostic techniques for Riemerella Anatipestifer infection2020-03-16发布2020-04-16实施山东省市场监督管理局 发布前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位:山东省农业科学院家禽研究所、山东省动物疫病预防与控制中心、威海市畜牧业发展中心、临沂市畜牧发展促进中心。本标准主要起草人:黄兵、李玉峰、马秀
2、丽、于可响、宋敏训、赵国清、秦卓明、刘存霞、林树乾、陈静、谭善杰、郭效珍、赵巧雅。鸭疫里默氏杆菌病诊断技术规程1 范围本标准规定了鸭疫里默氏杆菌病的临床诊断、细菌分离、病原核酸检测和综合判定的技术要求。本标准适用于鸭疫里默氏杆菌病的诊断与检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB 4789.28食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB 19489实验室生物安全通用要求NY/T 541兽医诊断
3、样品采集、保存与运输技术规范3 临床诊断3.1 流行病学该病一年四季均可发生,鸭、鹅、野生水禽和火鸡均可发病,1周龄8周龄鸭高度敏感,5周龄以下死亡较快,较大的鸭可能存活时间较长,该病在种鸭中少见。3.2 临床症状3.2.1 最急性型很少出现明显症状即突然死亡。3.2.2 急性型常见于2周龄3周龄的雏鸭,病程1日3日。患鸭精神沉郁、嗜睡、厌食、离群、不愿走动或行动迟缓,眼鼻分泌物增多,患鸭呼吸困难、缩颈或以喙抵地,濒死期出现神经症状呈角弓反张、抽搐等。3.2.3 慢性型常见于4周龄7周龄鸭,病程可达一周以上。主要表现为精神沉郁、厌食、腿软弱无力、不愿走动、伏卧或呈犬坐姿势,共济失调、痉挛性点头
4、或头左右摇摆,难以维持躯体平衡,部分病例头颈歪斜,当遇到惊扰时呈转圈运动或倒退,部分患鸭跛行。感染后存活的鸭往往生长迟缓。3.3 病理变化特征性病变为病死鸭浆膜出现广泛性的纤维素性渗出,包括心包炎、气囊炎和肝周炎。慢性病例可见脑炎。3.4 判定标准若发病鸭符合3.1流行病学特征、3.2临床症状和3.3病理变化,可判为鸭疫里默氏杆菌病疑似病例,应进行细菌分离和核酸检测确诊。4 实验室诊断除非另有规定,实验室诊断所用化学试剂均为分析纯;试验用水符合GB/T 6682二级水的规定;实验室生物安全要求按照GB 19489执行。4.1 细菌分离4.1.1 仪器和设备4.1.1.1 生物安全柜。4.1.1
5、.2 CO2培养箱。4.1.1.3 显微镜。4.1.2 试剂或材料4.1.2.1 血清琼脂平板(见附录A.1)。4.1.2.2 麦康凯琼脂平板(见附录A.2)。4.1.2.3 革兰氏染色液。4.1.2.4 瑞氏染色液。4.1.3 操作步骤4.1.3.1 取样按NY/T 541要求无菌采集发病鸭的肝脏或脑(有典型纤维素性渗出时采集肝脏,有神经症状时采集脑)。4.1.3.2 分离培养将接种环伸入组织内部,然后划线接种于血清琼脂平板和麦康凯琼脂平板,平板的配制根据根据GB4789.28的规定进行操作,含5%10% CO2 的37 培养箱或烛缸中培养24 h48 h。挑取符合4.1.3.3描述的典型菌
6、落,划线接种于血清琼脂平板进行纯化培养。4.1.3.3 菌落形态在血清琼脂平板培养基上见有湿润、呈露滴样、圆形隆起、表面光滑、边缘整齐的菌落,直径为1mm2 mm,颜色为灰白色;而麦康凯琼脂平板上无菌落生长。挑选单个典型菌落进行革兰氏染色和瑞氏染色,并镜检。革兰氏阴性,为无鞭毛、不运动、不形成芽胞的小杆菌。单个、成双或呈短链状排列,菌体形态除杆状外,部分呈椭圆形,偶见呈长丝状。细菌大小宽为0.2 m0.5 m,长为1 m5 m,呈丝状的菌体可长达11 m24 m。瑞氏染色可见大多数菌体呈两极着染。4.1.4 结果判定分离的细菌如同时符合4.1.3.3和4.1.3.4,可判定为疑似鸭疫里默氏杆菌
7、。4.2 病原核酸检测4.2.1 PCR方法4.2.1.1 仪器和设备4.2.1.1.1 高速冷冻离心机。4.2.1.1.2 PCR扩增仪。4.2.1.1.3 电泳仪。4.2.1.1.4 紫外分析仪。4.2.1.1.5 微量加样器:0.5 L10 L;2 L20 L;20 L200 L;100 L1 000 L。4.2.1.2 试剂或材料4.2.1.2.1 阴性质控。4.2.1.2.2 阳性质控(灭活细菌培养物)。4.2.1.2.3 蛋白酶K。4.2.1.2.4 PBS(附录B.1)。4.2.1.2.5 TE(附录B.2)。4.2.1.2.6 SDS(附录B.3)。4.2.1.2.7 琼脂糖凝
8、胶(附录B.4)。4.2.1.2.8 TAE电泳液(附录B.5)。4.2.1.3 样品处理及核酸提取4.2.1.3.1 组织样品无菌取疑似鸭疫里默氏杆菌病的肝脏、脾脏等脏器组织1.0 g5.0 g,按10%(g/mL)加入PBS,研磨匀浆。-20 保存备用。取100 L组织匀浆液加入400 L TE中充分混匀,再加终浓度为1%的SDS和100 g/mL的蛋白酶K,置56 水浴消化2 h,冷至室温后用酚及氯仿各抽提两次,无水乙醇沉淀,75%乙醇洗涤,最后用40 L DEPC水溶解DNA,作为PCR模板,或保存于-20 。或者用商品化的DNA提取试剂盒提取DNA。4.2.1.3.2 菌落样品挑取4
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