DB37∕T 3533-2019 驴骡马皮张源性成分鉴定 实时荧光定性PCR法(山东省).pdf
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1、ICS 65.020.01 B 40 DB37 山东省地方标准 DB 37/T 35332019 驴骡马皮张源性成分鉴定 实时荧光定性 PCR 法 Identification of donkey, mule/hinny and horse derived materials in leather Real-time fluorescent PCR method 2019 - 03 - 21 发布 2019 - 04 - 21 实施 山东省市场监督管理局 发 布 DB37/T 35332019 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4
2、 原理 . 1 5 试剂或材料 . 1 5.1 试剂 . 1 5.2 材料 . 2 5.3 配制溶液 . 2 6 仪器设备 . 3 7 检测用引物和探针 . 3 8 试验步骤 . 3 8.1 样本制备 . 3 8.2 DNA 提取 . 3 8.3 实时荧光 PCR 反应 . 3 9 试验数据处理 . 4 9.1 PCR 有效性判定 . 4 9.2 检测结果分析和表述 . 4 10 检测过程中防止交叉污染的措施 . 4 附 录 A (规范性附录) 实时荧光定性 PCR 引物/探针序列、反应体系和结果判定 . 5 附 录 B (资料性附录) 目的基因扩增靶标参考序列 . 7 DB37/T 3533
3、2019 II 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。 本标准由山东省畜牧专业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位:山东省农业科学院生物技术研究中心、山东东阿国胶堂阿胶药业有限公司、山东宏济堂制药集团股份有限公司、济南张景牧业科技发展有限公司。 本标准主要起草人:张全芳、胡悦、范阳阳、刘艳艳、董书光、徐慧敏、孟朝红、余彩娟、耿加亮、郝大魁、张同清、谭晴晴、步迅、陈淑娟。 DB37/T 35332019 1 驴骡马皮张源性成分鉴定 实时荧光定性 PCR 法 1 范围 本标准规定了驴、骡和马3种动物皮张源性成分的实时荧光定性PCR检测
4、方法。 本标准适用于动物皮张及初加工品中驴、骡和马3种源性成分的定性检测。 本方法检出限为0.5 %。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件, 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 实时荧光PCR real-time fluorescence PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团, 利用荧光信号积累实时监控整个PCR进程,
5、对未知模板进行定性或定量分析。 3.2 Ct值 cycle threshold 每个实时荧光PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 4 原理 根据核基因CKM(creatine kinase of muscle)为靶基因设计马属动物通用引物以及驴和马特异性探针, 采用TaqMan实时荧光PCR技术进行扩增, 根据PCR扩增反应的荧光信号及循环阈值, 判定动物皮张驴、马和骡3种动物源性成分。 5 试剂或材料 除另有规定外,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T 6682规定的一级水。 5.1 试剂 DB37/T 35332019 2 5.1.1 氯化钠(NaCl)。 5
6、.1.2 浓盐酸(HCl)。 5.1.3 三羟甲基氨基甲烷(Tris base)。 5.1.4 二水乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA2H2O)。 5.1.5 十二烷基硫酸钠(SDS)。 5.1.6 蛋白酶冻干品。 5.1.7 异硫氰酸胍(GuSCN)。 5.1.8 硅珠。 5.1.9 无水乙醇。 5.2 材料 5.2.1 驴、骡和马 3 种动物皮张源性成分实时荧光 PCR 定性检测试剂盒。 5.2.2 2TaqManMaster Mix:含有 Taq DNA 聚合酶(终浓度 1 U/20 L)、Mg2+(终浓度 2.0 mmol/L)、dNTPs(终浓度 0.2 mmol/L)。 5.3 配制
7、溶液 5.3.1 1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶液:称取 12.1 g 三羟甲基氨基甲烷置于 100 mL 烧杯中,加入80 mL 水, 用浓盐酸调节 pH 至 8.0, 转移至 100 mL 容量瓶中,加水定容至刻度, 103.4 KPa 蒸汽压 (121 )灭菌 20 min,室温保存待用。 5.3.2 1 mol/L Tris-HCl (pH 6.4)溶液:称取 12.1 g Tris 置于 100 mL 烧杯中,加入 80 mL 水,用浓盐酸调节 pH 至 6.4,转移至 100 mL 容量瓶中,加水定容至刻度,103.4 KPa 蒸汽压(121 )灭菌20 min
8、,室温保存待用。 5.3.3 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)溶液:称取 18.61 g 二水乙二胺四乙酸二钠置于 100 mL 烧杯中,加入 80 mL 水,用 10 %的氢氧化钠溶液调节 pH 至 8.0,转移至 100 mL 容量瓶中,加水定容至刻度,103.4 KPa 蒸气压(121 )灭菌 20 min,室温保存待用。 5.3.4 10 % SDS:称取 10 g 十二烷基硫酸钠溶解于 80 mL 无菌水中,转移至 100 mL 容量瓶中,加水定容至刻度。储存于灭菌过的容器中待用。 5.3.5 5 mol/L 氯化钠溶液:称取 29.22 g 氯化钠溶解于 80 mL 无
9、菌水中,转移至 100 mL 容量瓶中,加水定容至刻度,103.4 KPa 蒸汽压(121 )条件下灭菌 20 min,室温保存待用。 5.3.6 细胞裂解液(Lysis Buffer):取 1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)20 mL,0.5 mol/L 二水乙二胺四乙酸二钠(pH 8.0)5 mL,5.0 mol/L 氯化钠 10 mL,10 %十二烷基硫酸钠 5 mL,转移至 100 mL容量瓶中,加水定容至刻度。 5.3.7 20 mg/mL 蛋白酶 K 溶液:称取 0.2 g 蛋白酶冻干品,加水溶解,转移至 10 mL 容量瓶中,加水定容至刻度,分装后于-20 保存。
10、5.3.8 RNA 酶溶液:称取 1 g 冻干品 RNA 酶 A 溶解于 6 mL 无菌水中,于 100 加热 15 min,缓慢冷却至室温,转移至 10 mL 容量瓶中,加水定容至刻度,分装成小份存于-20 。 5.3.9 DNA 结合液:称取 60 g 异硫氰酸胍,加入 5 mL 1mol/L Tris-HCl(pH 6.4)溶液,再加入 8 mL 0.5 mol/L 乙二胺四乙酸二钠(pH 8.0),然后再加入 4 mL Trition X-100 溶液(温度 60 ),转移至 100 mL 容量瓶中,加水定容至刻度。 5.3.10 漂洗液:称取 60 g 异硫氰酸胍,加入 5 mL 1
11、 mol/L Tris-HCl(pH 6.4)溶液,再加入 8 mL 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0),转移至 100 mL 容量瓶中,加水定容至刻度。 DB37/T 35332019 3 5.3.11 TE 缓冲液:量取 0.5 mL 10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、0.1 mL 0.5 mol/L 乙二胺四乙酸二钠(pH 8.0)加入到容量瓶中,调节 pH 至 8.0,转移至 50 mL 容量瓶中,加水定容至刻度,103.4 KPa蒸汽压(121 )灭菌 20 min,降至室温,4 保存备用。 6 仪器设备 6.1 实时荧光定量 PCR 仪:4 通道以上。
12、 6.2 电子分析天平:感量 0.1 mg 或 0.01 g。 6.3 离心机:最大离心力不小于 13 000 g。 6.4 振荡型恒温金属浴:0 100 。 6.5 高压灭菌锅。 6.6 低温冰箱:-20 4 。 6.7 超净工作台。 6.8 微量移液器:100 L1 000 L,10 L200 L,2 L20 L,0.5 L10 L。 6.9 容量瓶:10 mL,50 mL,100 mL。 7 检测用引物和探针 内标质控引物探针序列和马属动物通用PCR引物、驴和马的特异性探针序列见附录A中表A.1,引物探针在序列中的位置参见附录B。 8 试验步骤 8.1 样本制备 盐干皮或鞣制皮张在平整处
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