GB 5009.24-2016 食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素M族的测定.pdf
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1、中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B5 0 0 9 .2 42 0 1 6食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素M族的测定2 0 1 6 - 1 2 - 2 3发布2 0 1 7 - 0 6 - 2 3实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局发 布G B5 0 0 9.2 42 0 1 6 前 言 本标准代替G B5 4 1 3.3 72 0 1 0 食品安全国家标准 乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定 、G B5 0 0 9.2 42 0 1 0 食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素M1和B1的测定 、G B/T2 3 2 1 22 0 0
2、8 牛奶和奶粉中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2的测定 高效液相色谱法-荧光检测法 和S N/T1 6 6 42 0 0 5 牛奶和奶粉中黄曲霉毒素M1、B1、B2、G1、G2含量的测定 。本标准与G B5 4 1 3.3 72 0 1 0相比, 主要变化如下: 标准名称修改为“ 食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素M族的测定” ; 增加了方法适用范围; 增加了对黄曲霉毒素M2的检测; 修改了酶联免疫法, 并修改第三法名称为酶联免疫吸附筛查法; 修改了液相色谱-质谱联用法; 修改了液相色谱法的前处理方法; 删除了免疫层析净化荧光分光度法。G B5 0 0 9.2 42 0 1 61
3、食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素M族的测定1 范围本标准规定了食品中黄曲霉毒素M1和黄曲霉毒素M2( 以下简称A F T M1和A F T M2) 的测定方法。第一法为同位素稀释液相色谱-串联质谱法, 适用于乳、 乳制品和含乳特殊膳食用食品中A F T M1和A F T M2的测定。第二法为高效液相色谱法, 适用范围同第一法。第三法为酶联免疫吸附筛查法, 适用于乳、 乳制品和含乳特殊膳食用食品中A F T M1的筛查测定。第一法 同位素稀释液相色谱-串联质谱法2 原理试样中的黄曲霉毒素M1和黄曲霉毒素M2用甲醇-水溶液提取, 上清液用水或磷酸盐缓冲液稀释后, 经免疫亲和柱净化和富集, 净化液浓
4、缩、 定容和过滤后经液相色谱分离, 串联质谱检测, 同位素内标法定量。3 试剂和材料除非另有说明, 本方法所用试剂均为分析纯, 水为G B/T6 6 8 2规定的一级水。3.1 试剂3.1.1 乙腈(CH3C N) : 色谱纯。3.1.2 甲醇(CH3OH) : 色谱纯。3.1.3 乙酸铵(CH3C OONH4) 。3.1.4 氯化钠(N a C l) 。3.1.5 磷酸氢二钠(N a2H P O4) 。3.1.6 磷酸二氢钾(KH2P O4) 。3.1.7 氯化钾(K C l) 。3.1.8 盐酸(HC l) 。3.1.9 石油醚(CnH2n+2) : 沸程为3 06 0。3.2 试剂配制3
5、.2.1 乙酸铵溶液(5mm o l/L) : 称取0.3 9g乙酸铵, 溶于10 0 0m L水中, 混匀。3.2.2 乙腈-水溶液(2 5+7 5) : 量取2 5 0m L乙腈加入7 5 0m L水中, 混匀。3.2.3 乙腈-甲醇溶液(5 0+5 0) : 量取5 0 0m L乙腈加入5 0 0m L甲醇中, 混匀。G B5 0 0 9.2 42 0 1 62 3.2.4 磷酸盐缓冲溶液( 以下简称P B S) : 称取8.0 0g氯化钠、1.2 0g磷酸氢二钠( 或2.9 2g十二水磷酸氢二钠) 、0.2 0g磷酸二氢钾、0.2 0g氯化钾, 用9 0 0m L水溶解后, 用盐酸调节
6、p H至7.4, 再加水至10 0 0m L。 3.3 标准品3.3.1 A F T M1标准品(C1 7H1 2O7,C A S:6 7 9 5 - 2 3 - 9) : 纯度9 8%, 或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。3.3.2 A F T M2标准品(C1 7H1 4O7,C A S:6 8 8 5 - 5 7 - 0) : 纯度9 8%, 或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。3.3.3 1 3C1 7- A F T M1同位素溶液(C1 7H1 4O7) :0.5g/m L。3.4 标准溶液配制3.4.1 标准储备溶液(1 0g/m L) : 分别称取A F T M1和
7、A F T M21m g( 精确至0.0 1m g) , 分别用乙腈溶解并定容至1 0 0m L。将溶液转移至棕色试剂瓶中, 在-2 0 下避光密封保存。临用前进行浓度校准( 校准方法参见附录A) 。3.4.2 混合标准储备溶液(1 .0g/m L) : 分别准确吸取1 0g/m LA F TM1和A F TM2标准储备液1 .0 0m L于同一1 0m L容量瓶中, 加乙腈稀释至刻度, 得到1.0g/m L的混合标准液。此溶液密封后避光4保存, 有效期3个月。3.4.3 混合标准工作液(1 0 0n g/m L) : 准确吸取混合标准储备溶液(1.0g/m L)1.0 0m L至1 0m L
8、容量瓶中, 乙腈定容。此溶液密封后避光4下保存, 有效期3个月。3.4.4 5 0n g/m L同位素内标工作液1(1 3C1 7- A F T M1) : 取A F T M1同位素内标(0.5g/m L)1m L, 用乙腈稀释至1 0m L。在-2 0下保存, 供测定液体样品时使用。有效期3个月。3.4.5 5n g/m L同位素内标工作液2(1 3C1 7- A F T M1) : 取A F T M1同位素内标(0.5g/m L)1 0 0L, 用乙腈稀释至1 0m L。在-2 0下保存, 供测定固体样品时使用。有效期3个月。3.4.6 标准系列工作溶液: 分别准确吸取标准工作液5L、1
9、0L、5 0L、1 0 0L、2 0 0L、5 0 0L至1 0m L容量瓶中, 加入1 0 0L5 0n g/m L的同位素内标工作液, 用初始流动相定容至刻度, 配制A F TM1和A F T M2的浓度均为0.0 5n g/m L、0.1n g/m L、0.5n g/m L、1.0n g/m L、2.0n g/m L、5.0n g/m L的系列标准溶液。4 仪器和设备4.1 天平: 感量0.0 1g、0.0 0 1g和0.0 0 00 1g。4.2 水浴锅: 温控5 02。4.3 涡旋混合器。4.4 超声波清洗器。4.5 离心机:60 0 0r/m i n。4.6 旋转蒸发仪。4.7 固
10、相萃取装置( 带真空泵) 。4.8 氮吹仪。4.9 液相色谱-串联质谱仪: 带电喷雾离子源。4.1 0 圆孔筛:1mm2mm孔径。4.1 1 玻璃纤维滤纸: 快速, 高载量, 液体中颗粒保留1.6m。4.1 2 一次性微孔滤头: 带0.2 2m微孔滤膜( 所选用滤膜应采用标准溶液检验确认无吸附现象, 方可G B5 0 0 9.2 42 0 1 63 使用) 。4.1 3 免疫亲和柱: 柱容量1 0 0n g( 柱容量、 回收率、 柱回收率验证方法参见附录B) 。注:对于每个批次的亲和柱在使用前需进行质量验证。5 分析步骤使用不同厂商的免疫亲和柱, 在样品的上样、 淋洗和洗脱的操作方面可能略有不
11、同, 应该按照供应商所提供的操作说明书要求进行操作。警示: 整个分析操作过程应在指定区域内进行。该区域应避光( 直射阳光) , 具备相对独立的操作台和废弃物存放装置。在整个实验过程中, 操作者应按照接触剧毒物的要求采取相应的保护措施。5.1 样品提取5.1.1 液态乳、 酸奶称取4g混合均匀的试样( 精确到0.0 0 1g) 于5 0m L离心管中, 加入1 0 0L1 3C1 7- A F T M1内标溶液(5n g/m L) 振荡混匀后静置3 0m i n, 加入1 0m L甲醇, 涡旋3m i n。置于4 、60 0 0r/m i n下离心1 0m i n或经玻璃纤维滤纸过滤, 将适量上
12、清液或滤液转移至烧杯中, 加4 0m L水或P B S稀释, 备用。5.1.2 乳粉、 特殊膳食用食品称取1g样品( 精确到0.0 0 1g) 于5 0m L离心管中, 加入1 0 0L1 3C1 7- A F T M1内标溶液(5n g/m L) 振荡混匀后静置3 0m i n, 加入4m L5 0热水, 涡旋混匀。如果乳粉不能完全溶解, 将离心管置于5 0的水浴中, 将乳粉完全溶解后取出。待样液冷却至2 0后, 加入1 0m L甲醇, 涡旋3m i n。置于4、60 0 0r/m i n下离心1 0m i n或经玻璃纤维滤纸过滤, 将适量上清液或滤液转移至烧杯中, 加4 0m L水或P B
13、 S稀释, 备用。5.1.3 奶油称取1g样品( 精确到0.0 0 1g) 于5 0m L离心管中, 加入1 0 0L1 3C1 7- A F T M1内标溶液(5n g/m L) 振荡混匀后静置3 0 m i n, 加入8 m L石油醚, 待奶油溶解, 再加9 m L水和1 1 m L甲醇, 振荡3 0m i n, 将全部液体移至分液漏斗中。加入0.3g氯化钠充分摇动溶解, 静置分层后, 将下层移到圆底烧瓶中, 旋转蒸发至1 0m L以下, 用P B S稀释至3 0m L。5.1.4 奶酪称取1g已切细、 过孔径1mm2mm圆孔筛混匀样品( 精确到0.0 0 1g) 于5 0m L离心管中,
14、 加1 0 0L1 3C1 7- A F T M1内标溶液(5n g/m L) 振荡混匀后静置3 0m i n, 加入1m L水和1 8m L甲醇, 振荡3 0m i n, 置于4、60 0 0r/m i n下离心1 0m i n或经玻璃纤维滤纸过滤, 将适量上清液或滤液转移至圆底烧瓶中, 旋转蒸发至2m L以下, 用P B S稀释至3 0m L。5.2 净化5.2.1 免疫亲和柱的准备将低温下保存的免疫亲和柱恢复至室温。5.2.2 净化免疫亲和柱内的液体放弃后, 将上述样液移至5 0m L注射器筒中, 调节下滴流速为1m L/m i nG B5 0 0 9.2 42 0 1 64 3m L/
15、m i n。待样液滴完后, 往注射器筒内加入1 0m L水, 以稳定流速淋洗免疫亲和柱。待水滴完后,用真空泵抽干亲和柱。脱离真空系统, 在亲和柱下放置1 0m L刻度试管, 取下5 0m L的注射器筒, 加入2 2m L乙腈( 或甲醇) 洗脱亲和柱, 控制1m L/m i n 3m L/m i n下滴速度, 用真空泵抽干亲和柱, 收集全部洗脱液至刻度试管中。在5 0下氮气缓缓地将洗脱液吹至近干, 用初始流动相定容至1.0m L, 涡旋3 0s溶解残留物,0.2 2m滤膜过滤, 收集滤液于进样瓶中以备进样。注:全自动( 在线) 或半自动( 离线) 的固相萃取仪器可优化操作参数后使用。为防止黄曲霉
16、毒素M破坏, 相关操作在避光( 直射阳光) 条件下进行。5.3 液相色谱参考条件液相色谱参考条件列出如下:a) 液相色谱柱:C1 8柱( 柱长1 0 0mm, 柱内径2.1mm, 填料粒径1.7m) , 或相当者。b) 色谱柱柱温:4 0。c) 流动相:A相,5mm o l/L乙酸铵水溶液;B相, 乙腈-甲醇(5 0+5 0) 。梯度洗脱: 参见表1。d) 流速:0.3m L/m i n。e) 进样体积:1 0L。5.4 质谱参考条件质谱参考条件列出如下:a) 检测方式: 多离子反应监测(MRM) ;b) 离子源控制条件: 参见表2;c) 离子选择参数: 见表3;d) 液相色谱-质谱图和子离子
17、扫描图: 见附录C。表1 液相色谱梯度洗脱条件时间/m i n流动相A/%流动相B/%梯度变化曲线0.06 8.03 2.00.56 8.03 2.014.25 5.04 5.065.00.01 0 0.065.70.01 0 0.016.06 8.03 2.06表2 离子源控制条件电离方式E S I+毛细管电压/k V1 7.5锥孔电压/V4 5射频透镜1电压/V1 2.5射频透镜2电压/V1 2.5G B5 0 0 9.2 42 0 1 65 表2( 续)离子源温度/1 2 0锥孔反吹气流量/ (L/h)5 0脱溶剂气温度/3 5 0脱溶剂气流量/ (L/h)5 0 0电子倍增电压/V6
18、5 0表3 质谱条件参数化合物名称母离子(m/z)定量子离子(m/z)碰撞能量e V定性子离子(m/z)碰撞能量e V离子化方式A F T M13 2 92 7 32 32 5 92 3E S I+1 3C - A F T M13 4 63 1 72 32 8 82 4E S I+A F T M23 3 12 7 52 32 6 12 2E S I+5.5 定性测定试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较, 变化范围应在2.5%之内。每种化合物的质谱定性离子必须出现, 至少应包括一个母离子和两个子离子, 而且同一检测批次,对同一化合物, 样品中目标化合物的两个子离子的相
19、对丰度比与浓度相当的标准溶液相比, 其允许偏差不超过表4规定的范围。表4 定性时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度/%5 02 05 01 02 01 0允许相对偏差/%2 02 53 05 05.6 标准曲线的制作在5.3、5.4液相色谱-串联质谱仪分析条件下, 将标准系列溶液由低到高浓度进样检测, 以A F T M1和A F T M2色谱峰与内标色谱峰1 3C1 7- A F T M1的峰面积比值-浓度作图, 得到标准曲线回归方程, 其线性相关系数应大于0.9 9。5.7 试样溶液的测定取5.2下处理得到的待测溶液进样, 内标法计算待测液中目标物质的质量浓度, 按第6章计算样品中待测物
20、的含量。5.8 空白试验不称取试样, 按5.1和5.2的步骤做空白实验。应确认不含有干扰待测组分的物质。G B5 0 0 9.2 42 0 1 66 6 分析结果的表述试样中A F T M1或A F T M2的残留量按式(1) 计算:X=Vf10 0 0m10 0 0(1) 式中:X 试样中A F T M1或A F T M2的含量, 单位为微克每千克(g/k g) ; 进样溶液中A F T M1或A F T M2按照内标法在标准曲线中对应的浓度, 单位为纳克每毫升(n g/m L) ;V 样品经免疫亲和柱净化洗脱后的最终定容体积, 单位为毫升(m L) ;f 样液稀释因子;10 0 0 换算系
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