DB21∕T 2734.1-2017 病菌PCR 分型诊断方法 第1部分:大肠杆菌PCR 检测方法.pdf
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1、ICS 11.220 B 41 DB21 辽宁省地方标准 DB21/T 2734.12017 病菌 PCR 分型诊断方法 第 1 部分:大肠杆菌 PCR 检测方法 Method of PCR typing diagnosis for bacterial Part1:Method of PCR detection for Escherichia coli 2017 - 02 - 23 发布 2017 - 03 - 23 实施 辽宁省质量技术监督局 发 布 DB21/T 2734.12017 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 缩略语 . 1 4 原理 .
2、 1 5 仪器和器材 . 1 6 试剂和材料 . 1 7 操作步骤 . 2 7.1 样品的采集、前处理、存放与运输 . 2 7.1.1 采样注意事项 . 2 7.1.2 采样工具 . 2 7.1.3 内脏样品的采集与前处理 . 2 7.1.4 内容物的采集与前处理 . 2 7.1.5 粪便的采集与前处理 . 2 7.1.6 血液 . 2 7.1.7 大肠杆菌纯培养物 . 3 7.1.8 保存与运输 . 3 7.2 PCR 检测. 3 7.2.1 DNA 提取. 3 7.2.2 PCR . 3 7.2.2.2 PCR 反应条件. 3 7.2.2.3 电泳 . 4 8 试验成立的条件 . 4 9
3、结果判定 . 4 附录 A(规范性附录) 试剂配制. 5 A.1 电泳缓冲液(50 倍). 5 A.1.1 0.5mol/L 乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液(pH 8.0) . 5 A.1.2 TAE(三羟甲基氨基甲烷一乙酸)电泳缓冲液(50 倍). 5 A.2 1%琼脂糖凝胶 . 5 DB21/T 2734.12017 II 前 言 标准病菌 PCR 分型诊断方法按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 标准病菌 PCR 分型诊断方法分为两个部分: 第 1 部分:大肠杆菌 PCR 检测方法; 第 2 部分:产气荚膜梭菌 PCR 分型检测方法。 本部分为病菌 PCR 分型诊断方法的
4、第 1 部分。 本分由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。 本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。 本标准起草单位:辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。 本标准主要起草人:赵凤菊、赵晓彤、关淼、关乃鹏、李蓉、陈瑶、张雅为、魏澍、李冰、高慎阳、蔡景明、王宏军、王竹、邓文超 DB21/T 2734.12017 1 病菌 PCR 分型诊断方法 第 1 部分:大肠杆菌 PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了大肠杆菌PCR检测方法的技术要求。 本标准适用于大肠杆菌的诊断、监测及流行病学调查,适用于动物粪便、脏器及纯培养物中大肠杆菌的检测。 本标准中的试验操作应在生物安全级(BSL-2)以上的实验室进
5、行。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件, 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 中华人民共和国农业部公告第302号 兽医实验室生物安全技术管理规范 GB 16548-2006 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 SN/T2025-2007 动物检疫实验室生物安全操作规范 GB/T 555-2002 动物产品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检测方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本标准。 E.coli:大肠杆菌(Escherichia co
6、li) DNA:脱氧核糖核酸(Diethylpyrocarbonate) bp:碱基对(base pair) PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction) dNTP:脱氧核糖核苷三磷酸(Deoxy-ribonucleoside triphosphate) Taq酶: Taq DNA聚合酶(Taq DNA polymerase) TAE:三羟甲基氨基甲烷-乙酸电泳缓冲液(Tris acetate-EDTA buffer) 4 原理 根据E.coli保守基因序列设计一对引物,在DNA聚合酶催化下,以母链DNA为模板,以引物为延伸起点,通过变性、退火和延伸,体外复制出
7、与母链模板DNA互补的子链DNA。 5 仪器和器材 DB21/T 2734.12017 2 本技术规范中需应用下列仪器和器材:高速台式冷冻离心机(最大离心力12 000 g以上)、冰箱、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统、微波炉、分析天平、15 mL离心管、1.5mL离心管和0.2 mL离心管、微量移液器和吸头等。 6 试剂和材料 6.1 DNA 抽提试剂:DNAzol Reagent,外观为淡绿色,于 48 保存。 6.2 无水乙醇:-20 预冷。 6.3 75 %乙醇:用无水乙醇和灭菌双蒸水配制,-20 预冷。 6.4 Taq 酶:Ex Taq DNA 聚合酶(5 U/L)。 6.5 dN
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