DB13∕T 5345-2021 猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型二重PCR检测方法(河北省).pdf
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1、 ICS 65.020.30 CCS B 41 DB13 河北省地方标准 DB 13/T 53452021 猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒 2型二重 PCR 检测方法 2021 - 01 - 21 发布 2021 - 02 - 21 实施 河北省市场监督管理局 发 布 DB13/T 53452021 I 前 言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第一部分:标准化文件的结构与起草规则的规定起草。 本文件由河北农业大学提出。 本文件起草单位:河北农业大学。 本文件主要起草人:袁万哲、赵款、张建虹、王建昌、韩荞忆、李丽敏、宋勤叶、董世山、李希明、张磊、李睿文、白云、郝雪飘。DB1
2、3/T 53452021 1 猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒 2 型二重 PCR 检测方法 1 范围 本文件规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型二重PCR检测方法的技术要求。 本文件适用于猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型的同时检测。 2 规范性应用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 试剂材料 4.1 病毒核酸提取试剂盒。 4.
3、2 1.0%琼脂糖凝胶,配制方法见附录 A 中 A.1。 4.3 50TAE 缓冲液,配制方法见附录 A 中 A.2。 4.4 溴化乙锭(EB,10 ug/ L)或市售核酸染料,配制方法见附录 A 中 A.3。 4.5 焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌双蒸水,配制方法见附录 A 中 A.4。 4.6 DNA 分子量标准(100 bp)。 4.7 反转录酶。M-MLV 反转录酶(200 U/ L)或 AMV 反转录酶(10 U/ L) 4.8 RNA 酶抑制剂。 4.9 2Taq MasterMix。含有 PCR 缓冲液、酶混合物、dNTP 混合物、无 RNA 酶的水等。 4.10 dNTP。
4、浓度为 2.5 mM。 4.11 引物。反转录引物、上游引物与下游引物见附录 B 中的表 B.1。引物浓度为 10 mol/L。 5 仪器设备 5.1 PCR 仪。 5.2 凝胶成像系统。 5.3 台式低温高速离心机。 5.4 电泳仪。 5.5 电泳槽。 5.6 冰箱。 DB13/T 53452021 2 5.7 微量移液器。单道可调;量程包括 0.5 L10 L、2 L20 L、10 L100 L、100 L1000 L。 5.8 水浴锅。 6 样品 6.1 阴阳性对照 以灭活的猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型细胞培养物或者感染猪组织作为阳性对照, 以正常细胞或者是正常猪组织作为阴性对
5、照。对照均应在-20 保存。 6.2 样品的采集与处理 6.2.1 采集工具 下列采集工具应进行灭菌处理: a) 棉拭子; b) 剪刀; c) 镊子; d) 1.5 mL 离心管; e) 研钵; f) 一次性无菌采样袋。 6.2.2 棉拭子采集 将棉拭子深入鼻腔转一圈;将采集后的棉拭子放入盛有1.0 mL PBS(配制方法见附录A中A.5)的1.5 mL离心管,编号。 6.2.3 血液采集 使用一次性注射器或采血管通过耳静脉或前腔静脉采血3 mL5 mL,编号。 6.2.4 组织采集 剖检生猪,用剪刀采集肺、脾、肾、淋巴结等组织,装入一次性无菌采样袋,编号。 6.2.5 样品储运 样品采集后放
6、入塑料袋内密封 (一个采集点的样品放一个塑料袋内) , 样品的储存应按照NY/T 541中条款7.1执行;样品的运输应按照NY/T 541中条款9执行。 6.2.6 样品的处理 6.2.6.1 棉拭子 将装有棉拭子的离心管在混合器上充分混合后,用高压灭菌的镊子将拭子中的液体挤出,4 条件下3000 r/min离心15 min,取上清液转入无菌的1.5 mL离心管中,编号备用。 6.2.6.2 血液 DB13/T 53452021 3 待血液凝固后,4 条件下5000 r/min离心10 min取上清液转入无菌的1.5 mL离心管中,编号备用。 6.2.6.3 组织 将所采集的组织置于洁净、灭菌
7、并烘干的搪瓷盘中,称取组织按照质量体积比(1:5)加入样品保存液进行充分研磨,4 条件下3000 r/min离心15 min。取上清转入无菌的1.5 mL的离心管备用,编号。 7 PCR 检测 7.1 核酸提取 使用商品化病毒核酸提取试剂,按照说明书进行操作。同时进行阴阳对照样品核酸的提取。 7.2 反转录 取6.1所得的核酸 11 L,加入2 L 10 mol/L的反转录引物(PRRSV-decR)、4 L 5反转录缓冲液、0.5 L反转录酶、0.5 L RNA酶抑制剂、2 L dNTP Mixture,42 水浴1 h,即得到cDNA溶液,直接用于后续的PCR扩增或-20 保存备用。 7.
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