SN∕T 5514-2023 出口食品中产毒素真菌快速检测方法 实时荧光PCR法.pdf
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1、I C S0 7.1 0 0.3 0C C S X0 4中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 5 1 42 0 2 3 出口食品中产毒素真菌快速检测方法实时荧光P C R法R a p i d d e t e c t i o n o f m y c o t o x i g e n i c f u n g i i n e x p o r t f o o dR e a l-t i m e P C R m e t h o d2 0 2 3-1 1-0 1发布2 0 2 4-0 5-0 1实施中华人民共和国海关总署发 布前 言 本文件按照G B/T 1.12 0 2 0 标准化工作导则 第1
2、部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国拱北海关、中华人民共和国海关科学技术研究中心、大连民族大学、中华人民共和国杭州海关、中华人民共和国郑州海关、中华人民共和国大连海关。本文件主要起草人:冯家望、姚丽锋、王小玉、蔡教英、游淑珠、曾静、张晓峰、丁琦、曾文祥、曾俊洁、郑秋月、苗丽、李可、黎财慧、刘陆。S N/T5 5 1 42 0 2 3出口食品中产毒素真菌快速检测方法实时荧光P C R法1 范围本文件规定了食品中产毒素真菌的实时荧光P C R方
3、法。本文件适用于食品中产黄曲霉毒素的黄曲霉和寄生曲霉、产玉米赤霉烯酮毒素禾谷镰刀菌、产单端孢霉烯族毒素禾谷镰刀菌的实时荧光P C R检测。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B 4 7 8 9.1 5 食品卫生微生物学检验 霉菌和酵母菌计数G B 4 7 8 9.1 6 食品卫生微生物学检验 常见产毒霉菌的鉴定G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法G B 1 9 4 8 9 实验室 生物安全通用要求G B/T
4、 2 7 4 0 3 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 实时荧光P C R r e a l t i m e P C R在P C R反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时监控整个P C R扩增过程。3.2 C T值 c y c l e t h r e s h o l d每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4 缩略语下列缩略语适用于本文件。a f l R:产黄曲霉毒素调控基因(a f l a t o x i n b i o s y n t h e s i s r e g u l a t o r y g e n e)C
5、t值:每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数(C:C y c l e,t:t h r e s h o l d)D NA:脱氧核糖核酸(d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d)d AT P:脱氧腺苷三磷酸(d e o x y a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e)d C T P:脱氧胞苷三磷酸(d e o x y c y t i d i n e t r i p h o s p h a t e)d G T P:脱氧鸟苷三磷酸(d e o x y g u a n o s i n e t r i p h
6、 o s p h a t e)d NT P:脱氧核苷酸三磷酸(d e o x y r i b o n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e)1S N/T5 5 1 42 0 2 3d T T P:脱氧胸苷三磷酸(d e o x y t h y m i d i n e t r i p h o s p h a t e)d UT P:脱氧尿苷三磷酸(d e o x y u r i d i n e t r i p h o s p h a t e)E D T A:乙二胺四乙酸(e a t h y l e n e d i a m i n e t e t r a
7、 a c e t i c a c i d)F AM:6-羧基荧光素(6-c a r b o x y f l u o r e s c e i n)I T S:内部转录间隔区(i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r)o m t-1:柄曲霉素转甲氧基霉基因(s t e r i g m a t o c y s t i n o-m c t h y l t r a n s f c r a s e g e n e)P C R:聚合酶链式反应(p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n)P K S 1
8、3:聚酮合成酶基因(p o l y k e t o n e s y n t h a s e g e n e)S D S:十二烷基磺酸钠(S o d i u m d o d e c y l s u l f a t e)T r i 5:单端孢霉烯前体合成酶基因t r i c h o d i e n e s y n t h a s e g e n eT r i s:三(羟甲基)氨基甲烷(t r i s(h y d r o x y m e t h y l)a m i n o m e t h a n e)UNG:尿嘧啶N-糖基化酶(u r a c i l N-g l y c o s y l a s e)
9、v e r-1:杂色曲霉素A脱氢酶基因(v e r s i c o l o r i n A d e h y d r o g e n a s e g e n e)5 方法原理本方法选用黄曲霉毒素生化合成过程中的三个关键基因:产黄曲霉毒素调控基因a f l R,柄曲霉素转甲氧基酶基因o m t-1和杂色曲霉素A脱氢酶基因v e r-1的有无来判断待检菌株是否能够产生黄曲霉毒素;选用单端孢霉烯前体合成酶基因T r i 5的有无来判断待检菌株是否能够产生单端孢霉烯族毒素;选用聚酮合成酶基因P K S 1 3的有无来判断待检菌株是否能够产生玉米赤霉烯酮毒素。另外,使用真菌共有的5.8 S r R NA的
10、I T S序列作为内标基因。6 主要设备及耗材6.1 天平:感量0.1 g。6.2 均质器。6.3 恒温摇床:2 5 1。6.4 高速台式冷冻离心机(离心力1 2 0 0 0 g)。6.5 涡旋振荡仪。6.6 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.7 生物安全柜。6.8 实时荧光P C R仪。6.9 不同量程移液器:1 0 0 L1 0 0 0 L、2 0 L2 0 0 L、1 0 L1 0 0 L、0.5 L1 0 L。6.1 0 离心管:2 mL、1.5 mL和0.2 mL。6.1 1 八连P C R管、不同量程移液器的配套吸头。7 材料与试剂试剂在没有特殊说明的情况下为分析纯,水为G B/
11、T 6 6 8 2规定的一级水。7.1 萨氏培养液:按照A.1执行。7.2 D NA提取液:按照A.2执行。7.3 R NA酶(1 0 m g/mL)。7.4 T a q D NA聚合酶。2S N/T5 5 1 42 0 2 37.5 d NT P:d AT P、d T T P、d C T P、d G T P。7.6 1 0P C R 缓冲液:2 0 0 mm o l/L T r i s-HC L(p H 8.4),2 0 0 mm o l/L k c l,1 5 mm o l/L M g C l2。7.7 阳性质控菌株:用产黄曲霉毒素菌株(如:黄曲霉标准菌株A s p e r g i l l
12、 u s f l a v u sC GMC C 3.4 4 0 8或者寄生曲霉A s p e r g i l l u s p a r a s i t i c u sC GMC C 3.1 2 4,或其他来源于正规保藏机构的合格菌株),单端孢霉烯族毒素菌株(如禾谷镰刀菌标准菌株F u s a r i u m g r a m i n e a r u mC F C C 8 0 3 5 7,或其他来源于正规保藏机构的合格菌株),产玉米赤霉烯酮毒素菌株(如禾谷镰刀菌标准菌株F u s a r i u m g r a m i n e a r u mC F C C 8 0 3 5 7,或其他来源于正规保藏机
13、构的合格菌株)。7.8 阴性质控菌株:用不产黄曲霉毒素、单端孢霉烯族毒素和玉米赤霉烯酮毒素菌株(如烟曲霉A s-p e r g i l l u s f u m i g a t u s C GMC C 3.5 3 0 1,或其他来源于正规保藏机构的合格菌株)。7.9 实验用引物探针序列及选用:对待检可疑菌,按照表1选用基因进行检测。基因的引物和探针按照表2中序列合成,加超纯水配制成1 0 0 m o l/L储备液,实时荧光P C R 扩增的引物和探针工作液浓度为1 0 m o l/L。食品中产毒素真菌特征基因扩增靶标参考序列参见附录B。表1 产毒素真菌荧光P C R基因选用可疑产毒素菌株选择检测
14、的基因产黄曲霉毒素菌株I T S,a f l R,o m t-1,v e r-1产单端孢霉烯族毒素菌株I T S,T r i 5产玉米赤霉烯酮毒素菌株I T S,P K S 1 3表2 产毒素真菌荧光P C R引物探针序列基因引物/探针名称引物/探针序列5.8 S r D NA-I T SI T S-F5-C T C T T G G T T C C G G C A T C-3I T S-R5-C G C AA T G T G C G T T C AAAGA-3I T S-P5-F AM-T GAAGAA C G C AG C GAAA T G C GA TA-B HQ 1-3调控基因a f l
15、 Ra f l R-F5-C G C C T C A T G C T C A TA C C C-3a f l R-R5-GAGA C G C TA C T G C TA C C A T-3a f l R-P5-F AM-AA T C AA C C A C C A C A C G C T C T-B HQ 1-3柄曲霉素转甲氧基酶o m t-1o m t-1-F5-C A C C GAAG C C A C GAAG-3o m t-1-R5-G C T GAGA T GA C C A C GA C-3o m t-1-P5-F AM-C C G C C GA C A T C GA C AA C-B
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