SN∕T 5655.6-2023 商品化试剂盒检测方法 预包装食品致敏原免疫分析法 第6部分:乳.pdf
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1、I C S6 7.0 5 0C C SX0 4中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 6 5 5.62 0 2 3 商品化试剂盒检测方法预包装食品致敏原免疫分析法第6部分:乳C o mm e r c i a l k i t t e s t m e t h o d I mm u n o a s s a y o f f o o d a l l e r g e n s i n p r e p a c k a g e d f o o d s P a r t 6:M i l k2 0 2 3-1 1-0 1发布2 0 2 4-0 5-0 1实施中华人民共和国海关总署发 布前 言 本文件按照G
2、B/T 1.12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。本文件为S N/T 5 6 5 5 商品化试剂盒检测方法 预包装食品致敏原免疫分析法 的第6部分。S N/T 5 6 5 5已经发布了以下部分:第1部分:麸质;第2部分:甲壳纲类动物;第3部分:蛋类;第4部分:花生;第5部分:大豆;第6部分:乳;第7部分:扁桃仁;第8部分:腰果;第9部分:榛子;第1 0部分:巴西坚果;第1 1部分:夏威夷果;第1 2部分:开心果;第1 3部分:胡桃。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本
3、文件起草单位:中华人民共和国广州海关、中华人民共和国沈阳海关、沈阳国际旅行卫生保健中心、大连民族大学。本文件主要起草人:王金玲、陈文锐、张莹、李莎、吴渺渺、李思德、刘津、梁颖婕、郑秋月。S N/T5 6 5 5.62 0 2 3引 言 食品致敏原是普通食品中正常存在的天然或人工添加物质,被过敏体质人群消耗后能够诱发过敏反应。S N/T 5 6 5 5 商品化试剂盒检测方法 预包装食品致敏原免疫分析法 规定了预包装食品中致敏原成分的酶联免疫吸附定量检测和胶体金免疫层析定性检测方法,旨在满足预包装食品致敏原标识、生产质控和食品安全检验监管的检测需求。S N/T 5 6 5 5 商品化试剂盒检测方法
4、 预包装食品致敏原免疫分析法 拟由下列1 3个部分构成。第1部分:麸质。第2部分:甲壳纲类动物。第3部分:蛋类。第4部分:花生。第5部分:大豆。第6部分:乳。第7部分:扁桃仁。第8部分:腰果。第9部分:榛子。第1 0部分:巴西坚果。第1 1部分:夏威夷果。第1 2部分:开心果。第1 3部分:胡桃。S N/T5 6 5 5.62 0 2 3商品化试剂盒检测方法预包装食品致敏原免疫分析法第6部分:乳1 范围 本文件规定了预包装食品中乳、酪蛋白、-乳球蛋白致敏原的酶联免疫吸附和乳致敏原的胶体金免疫层析测定方法。第一法乳酶联免疫吸附法适用于预包装食品中乳致敏原成分的定量检测。第二法酪蛋白酶联免疫吸附法
5、适用于预包装食品中酪蛋白致敏原成分的定量检测。第三法-乳球蛋白夹心酶联免疫吸附法适用于未经发酵或水解的预包装食品中-乳球蛋白致敏原成分的定量检测。第四法-乳球蛋白竞争酶联免疫吸附法适用于经过发酵或水解的预包装食品中-乳球蛋白致敏原成分的定量检测。第五法乳胶体金免疫层析法适用于预包装食品中乳致敏原的定性检测,也适用于预包装食品生产过程中为监控乳致敏原目的对生产原料和环境采样的定性检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B/T
6、 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法 AOA C G u i d e l i n e s f o r C o l l a b o r a t i v e S t u d y P r o c e d u r e s t o V a l i d a t e C h a r a c t e r i s t i c s o f a M e t h o d o f A n a l y s i s.A p p e n d i x M:V a l i d a t i o n p r o c e d u r e s f o r q u a n t i t a t i v e f o o d a l
7、l e r g e n E L I S A m e t h o d s:c o m-m u n i t y g u i d a n c e a n d b e s t p r a c t i c e s3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 乳 m i l k 哺乳动物分娩后从乳腺分泌的一种白色或带微黄色不透明液体。以生乳为原料可加工制成乳粉。乳中含有的酪蛋白和-乳球蛋白在具有营养价值的同时也具有致敏性。3.2 酶联免疫吸附测定 e n z y m e-l i n k e d i mm u n o s o r b e n t a s s a y;E L I S A 可溶性抗原或抗体
8、结合到微孔板等固相载体上,基于免疫反应和酶催化显色的一种定性或定量检测方法。1S N/T5 6 5 5.62 0 2 33.3 胶体金免疫层析 c o l l o i d a l g o l d i mm u n o c h r o m a t o g r a p h y a s s a y;G I C A 以胶体金作为示踪标志物的一种免疫层析检测技术。注:通常为试纸条形式。第一法 乳 酶联免疫吸附法4 原理检测的原理是抗原抗体反应。微孔板中包被有针对乳致敏原的特异性抗体。样品中含有的乳致敏原和特异性抗体结合形成抗体-抗原复合物。加入过氧化物酶标记的抗体后,形成抗体-抗原-抗体复合物,其他物质
9、在洗涤步骤中被除去。加入底物/发色剂呈显色反应。通过测定4 5 0 n m波长下吸光度值得出样品中乳致敏原含量。样品中乳致敏原含量与吸光度值成正比。5 试剂和材料 除特别说明外,实验用水应符合G B/T 6 6 8 2规定的三级水,所有试剂均为分析纯。5.1 乳致敏原酶联免疫吸附检测试剂盒:试剂盒按照AOA C G u i d e l i n e s f o r C o l l a b o r a t i v e S t u d y P r o-c e d u r e s t o V a l i d a t e C h a r a c t e r i s t i c s o f a M e t
10、 h o d o f A n a l y s i s A p p e n d i x M:V a l i d a t i o n p r o c e d u r e s f o r q u a n t i t a t i v e f o o d a l l e r g e n E L I S A m e t h o d s:c o mm u n i t y g u i d a n c e a n d b e s t p r a c t i c e s进行评价,评价结果见附录A。注:试剂盒详细信息见附录B。5.2 1 m o l/L氢氧化钠(N a OH):称取4 0.0 0 g N a OH,
11、加水溶解并定容至1 L。5.3 1 m o l/L盐酸(HC l):取8.4 mL浓盐酸(3 7%),用水定容至1 0 0 mL。5.4 1致敏原提取缓冲液:按照11 0比例稀释1 0致敏原提取缓冲液浓缩液 见B.1 e),稀释后的1致敏原提取缓冲液可贮于2 8 条件下保存1 2周。稀释前,若1 0致敏原提取缓冲液浓缩液中有结晶,则先将其置于3 7 水浴中温育,直至结晶完全消失,充分混匀后使用。5.5 含添加剂1的致敏原提取缓冲液:称取1.3 5 g添加剂1 见B.1 g),溶解于1 5 mL 1 m o l/L氢氧化钠(N a OH)(5.2)中,搅拌直至完全溶解,加入7 0 0 mL 1致
12、敏原提取缓冲液(5.4),用1 m o l/L盐酸(HC l)(5.3)将p H值调至9,再用1致敏原提取缓冲液(5.4)定容到7 5 0 mL,该提取缓冲液,可用于提取约4 5个样品。可在室温(2 0 2 5)条件下保存3周,不应冷藏,若出现晶体析出情况则即刻弃用。5.6 1提取液2:按照12比例用蒸馏水稀释2提取液2浓缩液 见B.1 f)。稀释后的1提取液2可用于提取约4 5个样品,可在室温(2 0 2 5)条件下保存约3个月。5.7 1洗涤缓冲液:按照11 0比例稀释1 0洗涤缓冲液浓缩液 见B.1 d),稀释后的1洗涤缓冲液可贮于2 8 条件下保存4周。1条微孔板需约1 5 mL 1洗
13、涤缓冲液洗涤。5.8 1酶标记物:用酶标记物缓冲液 见B.1 c)按照11 1比例稀释1 1酶标记物浓缩液 见B.1 b),现配现用。如移取1 0 0 L 1 1酶标记物浓缩液到1 mL的酶标记物缓冲液 见B.1 c)中稀释混匀,足够1条微孔板使用。6 仪器和设备6.1 酶标仪:具4 5 0 n m波长。2S N/T5 6 5 5.62 0 2 36.2 分析天平:感量0.0 1 g。6.3 涡旋混匀仪。6.4 冷冻离心机:转速4 0 0 0 r/m i n,温度4。6.5 水浴锅:3 7,6 0,1 0 0。6.6 单道移液器:2 0 L2 0 0 L,1 0 0 L1 0 0 0 L。6.
14、7 八道移液器:3 0 L3 0 0 L。7 分析步骤7.1 样品前处理和提取7.1.1 固体样品:对不少于5 0 g样品进行均质。称取1.0 0 g样品到5 0 mL离心管中,加入4 mL制备好的1提取液2(5.6),盖好管盖后用力上下颠倒混匀。在1 0 0 的水浴中加热1 0 m i n。用冰浴快速冷却至室温(2 0 2 5),加入1 6 mL预热至6 0 的含添加剂1的致敏原提取缓冲液(5.5),按照7.1.3进行下一步处理。7.1.2 液体样品:对不少于5 0 mL样品进行均质。吸取1 mL样品到5 0 mL离心管中,加入4 mL制备好的1提取液2(5.6),盖好管盖后用力上下颠倒混匀
15、。在1 0 0 的水浴中加热1 0 m i n。用冰浴快速冷却至室温(2 0 2 5),加入1 5 mL预热至6 0 的含添加剂1的致敏原提取缓冲液(5.5),按照7.1.3进行下一步处理。7.1.3 将经过7.1.1或7.1.2处理的样品,涡旋混匀,置于6 0 水浴中孵育1 0 m i n后,用冰水快速冷却,4 0 0 0 r/m i n 4 离心1 0 m i n或过滤,将上清液或滤清液用1致敏原提取缓冲液(5.4)按比例15 如移取1 0 0 L提取物上清液/滤清液到4 0 0 L 1致敏原提取缓冲液(5.4)中稀释混匀 稀释进行检测。至此稀释倍数为1 0 0倍。7.2 测定7.2.1
16、将预先包被有乳致敏原特异性抗体的微孔板 见B.1 a)插入微孔板架并做好标记,标准品和样品均设置双平行。宜一次检测不要超过3条微孔板条(2 4个板孔),以避免过大的孔间时间差造成对定量结果的影响。7.2.2 平行加入1 0 0 L标准品15 见B.1 h)l)和样品至微孔中,室温(2 0 2 5)孵育1 0 m i n。孵育结束后,倒去微孔中的液体,每个微孔加入2 5 0 L 1洗涤缓冲液(5.7),进行洗涤后,在吸水纸上拍干,洗涤3次。洗板结束后,每个微孔加入1 0 0 L 1酶标记物(5.8),室温(2 0 2 5)孵育1 0 m i n。孵育结束后,倒去微孔中的液体,每个微孔每次加入2
17、5 0 L 1洗涤缓冲液(5.7)洗涤并在吸水纸上拍干,洗涤3次。洗板结束后,每个微孔加入1 0 0 L底物/发色剂 见B.1 m),轻轻地水平振摇使其均匀混合,室温(2 0 2 5)避光孵育1 0 m i n。孵育结束后,加入1 0 0 L终止液 见B.1 n),水平振摇使反应完全,1 0 m i n内读取4 5 0 n m波长吸光度值。7.3 标准曲线制作和测定结果计算 以标准品25质量浓度为横坐标,以标准品平均吸光度值为纵坐标,绘制半对数曲线,计算样品液中乳致敏原浓度(c)。也可使用试剂盒配套分析软件R I D A S O F T W i n中c u b i c s p l i n e或
18、4 p模式进行标准曲线绘制和测定结果计算。3S N/T5 6 5 5.62 0 2 38 分析结果描述8.1 结果分析 固体样品中乳致敏原含量按公式(1)计算:Xs=csm1 0 0fV(1)式中:Xs 样品中乳致敏原含量,单位为毫克每千克(m g/k g);cs 样品液中乳致敏原浓度,单位为毫克每升(m g/L);f 样品稀释倍数;V 定容体积,0.0 2 L;m 样品的质量,单位为千克(k g);1 0 0 标准品浓度中包含的1 0 0倍稀释。液体样品中的乳致敏原含量按式(2)计算:Xl=clf(2)式中:Xl 样品中乳致敏原含量,单位为毫克每升(m g/L);cl 样品液中乳致敏原浓度,
19、单位为毫克每升(m g/L);f 样品稀释倍数。根据7.1制备样品液时的1 0 0倍稀释倍数已经包括在标准曲线中,样品稀释倍数f只考虑除此1 0 0倍以外的稀释倍数。计算结果保留小数点后两位有效数字。8.2 结果表述乳致敏原测定结果用于标签标识管理。乳致敏原测定结果小于定量限时,结果表述为“未检出乳致敏原”;乳致敏原测定结果大于定量限时,结果表述为“检出乳致敏原”并报告具体测定值。9 质量控制9.1 试剂失效出现以下情况之一表明试剂失效,不应进行测定或测定结果作废:a)贮存在试剂瓶中的发色剂颜色出现蓝色;b)加入终止液后标准品5(6 7.5 m g/k g)吸光度值0.8。9.2 变异系数 在
20、重复性条件下获得的两次独立测定结果的变异系数不应超过1 0%。1 0 检出限和定量限 本方法对乳致敏原的检出限为0.7 0 m g/k g(L),定量限为2.5 0 m g/k g(L)。4S N/T5 6 5 5.62 0 2 31 1 防污染措施1 1.1 食品样品的均质可能产生粉尘,为避免污染应在通风橱内进行样品均质的前处理操作。1 1.2 设备和器具用水冲洗后,用6 0%乙醇或异丙醇彻底清洁,以消除致敏原(蛋白质)污染。1 1.3 在试验过程中应戴手套操作。在称量、均质样品、样品提取及试剂盒检测四个检测阶段更换手套。第二法 酪蛋白 酶联免疫吸附法1 2 原理利用抗原-抗体特异性结合反应
21、,对样品中的酪蛋白致敏原含量进行酶联免疫吸附测定。样品中的酪蛋白致敏原被微孔中预先包被的酪蛋白特异性抗体捕获,形成抗原-抗体复合物,加入过氧化物酶标记的抗体后,形成抗体-抗原-抗体夹心复合物,其他物质在洗涤步骤中被除去。加入底物/发色剂呈显色反应,通过测定4 5 0 n m波长下吸光度值得到样品中酪蛋白致敏原含量。样品中酪蛋白致敏原含量与吸光度值成正比。1 3 试剂和材料 除特别说明外,实验用水应符合G B/T 6 6 8 2规定的三级水,所有试剂均为分析纯。1 3.1 酪蛋白致敏原酶联免疫吸附检测试剂盒:试剂盒按照AOA C G u i d e l i n e s f o r C o l l
22、 a b o r a t i v e S t u d y P r o c e d u r e s t o V a l i d a t e C h a r a c t e r i s t i c s o f a M e t h o d o f A n a l y s i s A p p e n d i x M:V a l i d a t i o n p r o c e d u r e s f o r q u a n t i t a t i v e f o o d a l l e r g e n E L I S A m e t h o d s:c o mm u n i t y g u i d a
23、n c e a n d b e s t p r a c t i c e s进行评价,评价结果见附录C。注:试剂盒详细信息见附录D。1 3.2 1 m o l/L氢氧化钠(N a OH):称取4 0.0 0 g N a OH,加水溶解并定容至1 L。1 3.3 1 m o l/L盐酸(HC l):取8.4 mL浓盐酸(3 7%),用水定容至1 0 0 mL。1 3.4 牛血清白蛋白(S e r v a,F r a c t i o n V),不含蛋白酶。1 3.5 1致敏原提取缓冲液:按照11 0比例稀释1 0致敏原提取缓冲液浓缩液 见D.1 e),稀释后的1致敏原提取缓冲液可贮于2 8 条件下保
24、存1 2周。稀释前,若1 0致敏原提取缓冲液浓缩液中有结晶,则先将其置于3 7 水浴中温育,直至结晶完全消失,充分混匀后使用。1 3.6 含添加剂1的致敏原提取缓冲液:称取1.3 5 g添加剂1 见D.1 g),溶解于1 5 mL 1 m o l/L氢氧化钠(N a OH)(1 3.2)中,搅拌直至完全溶解,加入7 0 0 mL 1致敏原提取缓冲液(1 3.5),用1 m o l/L盐酸(HC l)(1 3.3)将p H值调至9,再用1致敏原提取缓冲液(1 3.5)定容到7 5 0 mL,该提取缓冲液,可用于提取约4 5个样品。可在室温(2 0 2 5)条件下保存3周,不应冷藏,若出现晶体析出
25、情况则即刻弃用。1 3.7 1提取液2:按照12比例用蒸馏水稀释2提取液2浓缩液 见D.1 f)。稀释后的1提取液2可用于提取约1 5个样品,可在室温(2 0 2 5)条件下保存约3个月。1 3.8 1洗涤缓冲液:按照11 0比例稀释1 0洗涤缓冲液浓缩液 见D.1 d),稀释后的1洗涤缓冲液可贮于2 8 条件下保存4周。1条微孔需约1 5 mL 1洗涤缓冲液洗涤。1 3.9 1酶标记物:用酶标记物缓冲液 见D.1 c)按照11 1比例稀释1 1酶标记物浓缩液 见D.1 b),现配现用。如移取1 0 0 L 1 1酶标记物浓缩液到1 mL的酶标记物缓冲液 见D.1 c)中稀释5S N/T5 6
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