GB∕T 40458-2021 用于病原微生物高通量检测的核酸提取技术规范.pdf
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1、ICS 66.020.01 CCS B 16 GB 中华人民共和国国家标准GB/T 40458-2021 用于病原微生物高通量检测的核酸提取技术规范Specification of nucleic acid extraction used for high-throughput detection of pathogenic microorganisms 2021-08-20发布国家市场监督管理总局毕+国家标准化管理委员会也叩2022-03-01实施GB/T 40458-2021 目Ij1=1 本文件按照GB/T1.1-2020(标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请
2、注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国植物检疫标准化技术委员会CSAC/TC271)提出并归口。本文件起草单位:中国检验检疫科学研究院、中山海关技术中心。本文件主要起草人:姜帆、张永江、陈健、岳巧云、邱德义。I 1 范围用于病原微生物高通量检测的核酸提取技术规范GB/T 40458-2021 本文件规定了利用二代测序技术对病原微生物进行高通量检测的核酸的提取要求,描述了对应的提取方法。本文件适用于植物及其产品的植物病原细菌、真菌、病毒和病媒生物携带的细菌的核酸提取方法。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。
3、其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB 19489 实验室生物安 全通用要求SN/ T 2752.4 卫生检疫人员的自我防护规范第4部分:实验室人员SN/ T 2776 国境口岸医学媒介生物监测实验室管理要求SN/ T 4278-2015 国境口岸医学媒介昆虫DNA条形码鉴定操作规程SN/ T 4625- 2016 DNA条形码筛选与质量要求3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4 缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA:脱氧核糖核酸CDeoxyribonucleicAcid) OD:光密度COptic
4、alDensity) PCR:聚合酶链式反应CPolymeraseChain Reaction) RNA:核糖核酸CRibonucleicAcid) 5 总体要求核酸提取主要包括生物样品的裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程,纯化则是使核酸与裂解体系中的其他成分,如蛋白质、多糖、脂类等其他组织或者细胞成分彻底分离的过程。核酸提取应保证核酸一级结构的完整性。排除其他分子,如蛋白质、多糖、脂类、有机溶剂等的污染,保证下游高通量检测试验顺利进行。试验过程中应防止外界环境(如灰尘、气榕胶、RNA酶等)对核酸提取的污染,以及病原物本身及试GB/ T 40458-2021 验过程
5、中的废弃物、废弃液等对环境的污染。在整个试验操作过程中应采用安全有效的防护措施。具体要求应符合GB19489,SN/ T 2752.4,SN/ T 2776中的规定。6 提取步骤6.1 细胞裂解从组织中提取核酸应先将组织分散成单个细胞,然后破碎胞膜及核膜,使核酸释放出来。从各种不同来源的样品中提取高纯度的病原微生物核酸,因细胞结构及所含成分不同,样品预处理的方式也不同,植物及其产品、动物组织等宜采取液氮研磨的方式。6.2 核酸的分离纯化核酸样品中不应存在其他生物大分子(如蛋白质、多糖、多盼和脂类等).以及不应存在对酶(如核酸内切酶、DNA聚合酶等)有抑制作用的成分。同时,应排除其他核酸分子的污
6、染,例如.DNA样品中应去除污染的RNA.反之RNA中应去除DNA。针对不同来源样品的具体核酸提取方法按附录A和附录B的规定执行。6.3 核酸质量检测6.3.1 核酸的完整性检测将提取的核酸样品CDNA或RNA)进行琼脂糖凝胶电泳或芯片检测,并与核酸分子量标准对照。完整性较好的DNA样品呈现出明显而清晰的单一条带,完整性较好的RNA样品呈现出三条带,亮度依次递减。6.3.2 核酸的浓度和纯度检测利用仪器检测核酸的浓度及纯度:核酸浓度可在仪器上直接读出,核酸样品纯度用ODZ60/0Dz80值检测,纯度较高的DNAODZ60/0D280值应为1.71.9 .RNA ODZ60/0Dz80值应为1.
7、82.0。6.3.3 PCR法进一步检测核酸质量宜采用PCR法进一步检测核酸质量,按照SN/T4278-2015中的7.4执行,扩增引物按照SN/ T 4625-2016中的8章、9章执行。出现目的片段的扩增产物可用于后续高通量检测。细菌、真菌高通量检测宜采用扩增子测序分析,病毒高通量检测宜采用小RNA测序分析。7 样晶保存与记录7.1 样晶保存提取出的核酸样品应先进行分装,妥善保存在80 C超低温冰箱中,以保证其在后续分析中的稳定性,避免反复冻融。7.2 结果记录应做好样品来源、取样人员、核酸浓度、核酸纯度、电泳结果图等文档的登记、标记和存档,便于复核。2 A.1 适用范围附录A(规范性)植
8、物病原微生物的核酸提取方法GB/T 40458-2021 本方法适用于从植物及其产品中提取病原微生物DNA和/或RNA,适用范围 广,可实现植物病原细菌、真菌、病毒的DNA和RNA共提取。A.2 试剂或材料除非另有规定,仅使用分析纯或生化试剂。OMEGA E.Z.N.A. Plant DNA/ RNA KitCR6733)试剂盒J)C包括:CPL缓冲液、DNA洗涤缓冲液、PR缓冲液、RWC洗涤缓冲液、RNA洗涤缓冲液H、DNA吸附柱、RNA吸附柱)、2琉基乙醇、三 氯甲皖、无水乙醇。A.3 仪器设备组织细胞破碎仪、高速离心机、振荡器、水浴锅、超微量分光光度计、电泳系统、凝胶成象系统、电子分析天
9、平(分度值为0.001g)、超净工作台、4C冰箱、-80C超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、微波炉。A.4 样品携带病原细菌、真菌、病毒的植物及其产品。A.5 提取步骤A.5.1 核酸提取前处理方法称取200mg2 g植物样品或植物种子在液氮中研磨至粉末状,将植物样品粉末或植物种子粉末转入1.5mL离心管中,为保证后续核酸提取质量,每个1.5mL离心管中植物样品粉末100mg或植物种子粉末40mg。随后向每个1.5mL离心管中加入500f-L CPL缓冲液(使用前,每1mL CPL缓冲液加入20L2琉基乙醇?昆合,11昆合液可在室温条件下保存1个月),55 C水浴10min, 加入500L三氯甲
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