GB∕T 40194-2021 大麦条纹花叶病毒检疫鉴定方法.pdf
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1、ICS 65.020.01 CCS B 16 中华人民共和国国家标准GB/T 40194-2021 大麦条纹花叶病毒检疫鉴定方法Detection and identification of Brle y stri pe moslC Vlrus 2021-05-21发布国家市场监督管理总局Lg.-/;-国家标准化管理委员会以叩2021-12-01实施G/T 40194-2021 目。吕本文件按照GB/T1. 1-2020标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(S
2、AC/TC271)提出并归口。本文件起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国福州海关。本文件主要起草人:张永江、沈建国、辛言言。I 大麦条纹花叶病毒检疫鉴定方法1 范围本文件规定了大麦条纹花叶病毒的血清学和分子生物学检疫鉴定方法。本文件适用于可能带有大麦条纹花叶病毒的植物及其产品的检疫鉴定。2 规范性引用文件G/T 40194-2021 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/ T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义本文
3、件没有需要界定的术语和定义。4 大麦条纹花叶病毒基本信息学名:Barleyst门户emosalC Vlrus 缩写:BSMV异名:Brleyfilse sti户eVIus、Bleymild stri户emosIC Vlrus、Brleymild st门户eVlrus、Barley mosaic vius、B-leyst门户emosaic hodeivius、Barleyvery mild st门户emosalC Vlrus、Oatstn户emosIC Vlrus、SetriemosalC VIus 分类地位:马泰利病毒目CMtellivirales)植物杆状病毒科CVigiridae)大麦病毒
4、属CHordei virus)成员。大麦条纹花叶病毒的其他信息参见附录A。5 方法原理大麦条纹花叶病毒的血清学特性和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据。根据BSMV与抗体之间的特异性反应,对植物样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定CDAS-ELISA);依据BSMV的基因组特征进行RT-PCR、实时荧光RT-PCR检测;通过这些方法的有效组合,判断样品是否带有BSMV。6 仪器用具与试剂6.1 仪器设备6.1.1 电子天平(感量0.001g)。6.1.2 高速冷冻离心机。G/T 40194-2021 6.1.3 微型瞬时离心机。6.1.4 普通冰箱。6.1.5 超低温冰箱(-80OC)。6.1.6
5、 制冰机。6.1. 7 涡旋振荡器。6.1.8 磁力搅拌器。6.1.9 高压灭菌锅。6.1.10 pH 计。6.1.11 超净工作台。6.1.12 实时荧光定量PCR仪。6.1.13 PCR 义。6.1.14 微波炉。6.1.15 电泳仪。6.1.16 电泳槽。6.1.17 凝胶成像分析仪。6.1.18 洗板机。6.1.19 酶标仪。6.1.20 酶联板。6.1.21 可调移液器(2.5L、10L、20L、100L、200L、1000L)。6.1.22 可调移液器头。6.1.23 Eppendorf管。6.1.24 研钵。6.1.25 微型磨样。6.2 试剂除另有规定外,所有试剂均为分析纯,试
6、验用水应符合GB/T6682中相关规定。6.2.1 DAS-ELISA检测试剂,制备按附录B中B.1执行。6.2.2 RT-PCR检测试剂,制备按附录C中C.1执行。6.2.3 实时荧光RT-PCR检测试剂,制备按附录D中D.1执行。7 检测样晶的制备7.1 种子挑取畸形、不成熟种子播于灭菌士中,待长出3片4片叶后将表现症状的植株编号;未表现症状的植株分组00株为1组)并编号,采集的未表现症状的叶片分成2份;用于酶联测定和分子生物学检测。也可以挑取畸形、不成熟的种子直接进行酶联测定和分子生物学检测。7.2 植株对于有症状(如叶片条纹、花叶、褐色细小斑点等)的植株,每个植株编号并进行单株检测。没
7、有症状的分组并编号后按组进行检测,分组方法和检测方法同7.1。7.3 植物产品植物产品有症状的部分(如条纹、花叶等)单独编号检测。没有症状或无法观察症状的植物产品,分2 G/T 40194-2021 组编号,分组方法和检测方法同7.1。8 检测鉴定8.1 双抗体夹心酶联免疫吸附测定包被抗体后,再把制备的样品上清液加入已包被BSMV抗体的酶联板中,进行DAS-ELISA检测。每个样品平行加到两个孔中。健康的植物组织作为阴性对照,感染BSMV的植物组织作为阳性对照,样品提取缓冲液作为空白对照;其中阴性对照的植物种类和材料(如叶片)应尽量与检测样品相一致。具体操作按B.2的规定执行。8.2 RT-P
8、CR中金泪RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同8.1,灭菌双蒸水作为空白对照。分别提取样品和对照的总RNA,反转录合成cDNA后进行PCR检测,具体操作按C.2的规定执行。如采用商品化一步法试剂盒,则按照试剂盒说明进行。8.3 实时荧光RT-PCR检测实时荧光RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同8.1,灭菌双蒸水作为空白对照。分别提取样品和对照的总RNA,反转录合成cDNA后进行实时荧光PCR检测,具体操作按D.2和D.3的规定执行。如采用商品化一步法试剂盒,则按照试剂盒说明进行。9 结果判定DAS-ELISA、RT-PCR和荧光RT-PCR检测方法按照B.3、C.3、D.4的判定方法进行
9、判定,其中任意两种检测方法的结果为阳性即可判定样品携带BSMV。10 样品保存与结果记录10.1 样晶保存经检测确定携带BSMV的样品应保存在适合的条件下以备复核。如种子保存在干燥室温环境中;种苗、叶片等样品保存在超低温冰箱(-80OC)中;做好登记和标记工作,保存期限至少1年。10.2 结果记录记录包括样品来源、种类、检测时间、地点、方法和结果、检测人员签字。DAS-ELISA检测应有酶联反应数值;RT-PCR检测应有电泳图片;实时荧光RT-PCR检测应有荧光曲线图。3 G/T 40194-2021 A.1 寄主范围附录A(资料性)大麦条纹花叶病毒相关资料寄主范围有限,自然寄主主要为大麦CH
10、ordmvulgare)、栽培二棱大麦CH. distichon )、小麦C Triticum aestivum)和野燕麦CAvenafatu)。A.2 危害症状受侵染的大麦在兰叶期时即出现褐色分散的细小斑点,后逐渐增多引起叶片枯死。有的品种沿叶片中脉出现褐色条斑,在上部叶片出现黄绿相间的花叶和斑驳。轻病株能抽穗,但千粒重明显降低。小麦感染大麦条纹花叶病毒,发病轻的,叶片上只有褪绿小斑驳;发病中等的,在叶片上出现较大的褪绿斑驳;发病中等偏重的,则出现黄色花叶或坏死斑块;发病严重的则使整张叶片变成黄白色。病株所结种子不饱满,千粒重不同程度地降低。A.3 分布地区中国、以色列、日本、韩国、黎巴嫩、
11、巴基斯坦、叙利亚、突尼斯、土耳其、埃及、澳大利亚、新西兰、丹麦、匈牙利、罗马尼亚、德国、墨西哥、美国、阿根廷、巴西、秘鲁、加拿大、南非、俄罗斯、智利、波兰、保加利亚、芬兰、捷克、葡萄牙、摩尔多瓦、瑞士、塞尔维亚、黑山、斯洛伐克、斯洛文尼亚、乌克兰、希腊、意大利、英国、朝鲜。A.4 传播方式该病毒主要通过种子传播,也可通过花粉传播。种传率分别为大麦90%100%,小麦7%81%,野燕麦22%,燕麦010%,长穗燕麦草22%,无芒燕麦8%,鸭町草8%,玉米90%100%,黑麦草属3%8%。A.5 粒体形态病毒粒体为棒状,长度在50nm150 nm,大多数为110nm;直径约为20nm。A.6 基因
12、组基因组为正单链RNA,由三个组分组成,其中组分RNA的长度约3.7kb,组分RNA卢的长度约3.2 kb,组分RNAy的长度在不同株系问差别较大,约2.7 kb3.1 kb。4 B.1 试剂B. 1. 1 包被抗体附录B(规范性)双抗体夹心酶联免疫吸附测定CDAS-ELISA)G/T 40194-2021 特异性大麦条纹花叶病毒抗体。建议使用商品化试剂盒抗体;4oc保存不超过1年;抗体使用时的稀释比例按说明书要求稀释。B.1.2 酶标抗体碱性磷酸醋酶标记的大麦条纹花叶病毒抗体。B.1.3 底物对硝基苯磷酸二铀CpNPP)。B. 1.4 1 X PST缓冲液CpH7.4) 氯化铀CNaCD磷酸
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