NY∕T 3752-2020 向日葵品种真实性鉴定 SSR分子标记法[农业].pdf
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1、ICS 65.020.01 30 NY 中华人民共和国农业行业标准NY /T 3752-2020 向日葵品种真实性鉴定SSR分子标记法Sunflower(Helianthus annuus L.) variety genuineness identification-SSR-based methods 2020 -11-12发布2021-04-01实施-中华人民共和国农业农村部发布NY /1 3752-2020 目次1/11言. 11 l 范f罚2 规范性Jlm文件3 术语和在义4封illl件f.2 5 J.月II. . 2 6 检测方案. .2 7 仪.N设衍、试剂和消液配111J8 检测秸
2、Ui9 鉴定应见10 结果拟f17附RA(资料性IIH及)浴&lftJ. . 10 Iq-l;J !(资料性附录)34XJ SSR I物标记1,包荧光的号|物分纠方来.12 附录巳(资料性IlfU)匀z位变异扩增片段信息、 . . 13 附示1)(资料性附录)参照样品放其匀位炎、外信dU、. 18 NY jT 3752-2020 牛;标州111全l 斗农作物种子标111化技术委员会(SACj丁C37)归仁l。本标时IJ兰申Jy!位:全同农业技术jJ服务中心、吉林t1城市农业科学院、亦峰TIT农牧科学研究院、黑龙江t农业科学院、内蒙古自治区农牧业科学院、新疆农民科学院。4:标月1主要起草人.张5
3、2、支l二1振、牛庆杰、赵主lt宋、1吁芳、刘丰洋、孙鹦可、李,英、任吗贞、11I娟、蓝玉迫、张币、二F学鹏、王祉陆、。,ii丽萍、绪堂、二Fn;u峰、刘!目利。11 NY /1 3752- 2020 向日葵品种真实性鉴定SSR分子标记法范围本标ll1规定了利JII简单屯纭序列CSimplesequencc repcRt. SSR)分子标记Ik且H丁InJU葵CHelialll/Il川川川iS1. ) JWlfl止:tnl揣测的术fl,fnk义且幽幽幢幢幢幽监仪m设备、i嗣同l浴IfilC *1 , ,f, ilj!1 ;t, F(鉴定也1),1,111纺织报告。本标I1U孟fll于 向门葵J
4、111和Ildcrivcd varictics! I二DV)(10%2 规范性引用文件下列文件对于本儿是不剖问j剧的寻|G 1:l!T 354:l. 1 GB/ T 3513. GB/丁:l543.GB/ T 6682 3 术语和定义下列术闹剧l3.1 3.2 品种真实l主把与Jtx.1!业,d,fil品种真经SSR名称。3.3 标准样品standard 同家指定机构保存的3.4 SSR指纹数据比对平台SSR lngerprint 采j川川11S岱SR标L记t的|内甘忡t标孟J叫州11化j方J法1尘l去;刘l品EV队l忡呐,1刷l标f时111样lJ1hH山仿吉)忠忠且丛、技术!所9川构L注IH
5、I白怦的l(内甘j占l川l分子数扭抗挝!H衍f古ij息占总、(I检索比;,1载体。3.5 参照样品rcfcrcm:c sample 具有SSR位lh_l主要tf位变异的品种.mf前IWJ价比试验样1111的等位变异,校E仪器设备的系统以差。3.6 引物组合primer pancl 用来以大能力15分l句川葵,tlrflr的J9i干l引物的集合。NY /1 3752-2020 4 缩赂i吾下;yi)缩略目1适用于本文件。hp碱基对(lmsepair) CTA, /六炕基=ql基泱化做(cclyllrimethylamlllonium bromide) DNA,脱氧核糖核酸Cdeoxyribonu
6、clecacid) dNTPs,J/ll.筑核粉1核+=磷同友们leoxy-rihonucleoside tri pllosphatcs) PACE, *P,Hlii民V!古凝)&11:泳(polyacrylamidcgcl clectrophoresis) PCR聚合附链式反应(polymerasechain reaction) SDS, /一炕W!l主俐Csoclium汇lodccylsulfalC) SSR简单JI复序列(约implesequence repeat) EDI八乙二)tii四乙酸(cthylencdiarninctetraacetic acid) TB-:A圣IJl1人氮拉
7、IJI炕姗同主主!i乙二l胶Il!I乙再在二钊(丁risBorate巳D、A)Tris二经IJq,j;氨基IJl炕tris(hydroxymcLhyl) aminomethanc1 /aq f;j, WIH热DNA*合fl a(1DNA polymerase ) 5 原理In) FI葵不|口l品种的基l对m存在ff够|业代稳定边传的简单喷复!于纠/(SSR)的重复次数差异。这种差异可以通过从试验丰lIIII-j:1扭tDNI气,mSSR J1物进行书附和11,泳,从而丰1/川扩增片段大小不同ifiIx:分品种。依据SSR标记检j!ll肪(Jlli采mSSR引物,边过与标lfI样tiffi比较或
8、与SSRj肯纹数据tt5N斗台比对的方式,对品种具实nill行!J创1或身份鉴店。.比例蹄证依据SSR位(羔异敛EliTIi户/;t, 1d, ,J/ :ji、性身份鉴定依以被检SSRi立点兀差异原则迸行筛查、鉴定。6 检测方案6. 1 总贝I)对二fl过实性鉴.,物、检测、FfT、样tfll状况不同Jt检测结果的IfH向皮、和确JjtI可能有所不同。Jjf.依据适于检视IIH的的原则.统y.r考虑检测规模和检视Il力,烨定适h:的:H物、检视IJjI-f、样品状况,;JirJrJ中11j业的检测方案。.(UfM;j/ill条刊下,合成选择的引物,按照确定的检测斗台;.)供检样JllII按DN
9、AJl椒、PCRjJ增、电泳、数据分析的也lrr进行检测。按规定2f求J报检测结果,检测报告应注明l检测方案所边择的J;III检测结果的关键信息。DNA挺JfK、PCR书J11和电泳的技术条1/要求,在iE于检测目的和l不Ji1听l检测质址的前提下,按照检测平行的要求允i.1井1*标IfUI规定作出适虫:(11.训整o6.2 检测平台6.2 1 对于向日葵品种具实性验iE或身份鉴定,可边界采HI变性PAGt:垂直扳l包泳l!X毛当u笆11:泳,如市要矛IIJIjSSR指纹数据比对、ILf , !WJ ffi:利用参!任中!(.:M,确定JE检样品的指纹后.再进行Hj性身份鉴定。6.2 2 xl
10、于f(:/fi,数-Irl:较大的,可将组织iDfJ仪、DNA自动提、l1 i;JJ移被工作站、115i且i盐PCR扩增仪、毛纠IIW也泳ill行组合.以tiiE气5检测的综合效率。6, 3 引物631 逃逃了3x.1 SSR J1物作为JlfI利J工实性!J!.l和身价格定(I(JJ /物.具体见表1, i:J 1物编号为SFPOISFP34,.JH如此构建了1;1R葵登记,IM/(g SSR j肯纹数据比1l平台。2 NY /T 3752-2020 表1引物信息编:J引物名称连锁1吓1以制.)1物Jt州白叶,) 5FP口lORS95D J.(; 1 5S Fl(;(TAACTATAiAC(
11、;CTATI I仁们TCCT(TIC ( :CATCAiTCTIA1 SFP02 R$.142 I.G2 55 F,CA(1(;ATAl兀1、AITCAAAR. 1( :TrCiTCAG(;TnGTCIU A 5FP03 。RS10:)61,(;:) F,Cl飞ITICAlITCCTAITITCTATrCA:J:) R, CTAiCA( :GCCT(,(;(;I八J(:ATIT(5FPO1 。R5:137GCGI SFP05 。R5210SFP06 。RS57SFP7 SFPOR SFI09 SFPIO SFP门SFPI2 SFPI3 日1114SFP15 日FP16日FP175FI18 ()
12、RS943 SFPI9 RS229 八CU;AA1-Cl-rAll;八A(日F P20。R5203F,(;Cn;八AG八n;TGAAC;C(;A八rGR,CTC八(;iiCAl:(;A(O ;AACCACI 日FP21ORS188 u;) 1, ( C(,ATrl叼八lIUTCITIUA55 R, CT( (;(;T(;Al沃;ATITG(;iTI日F P22(mS665 I.G3/ 16 55 F, (:CI( ATGAC( ;TAIU;ATCTC ( 1 R, TC:CAAATAC八Acr(;C(;AAA 51123 门A12 S H1.(;,1 F,(:TGTGA八1(;1(;A(;T(
13、 :TGAATCC 55 R,(:TCiCAl;nGCATAICCATCC 5FP24 OIS53:l I.G5 l八(;(;AAAGAAG(:AA(:(二CGAGA;) R: TCClCGAC;VJ(、ACTATrCGASFP25 ORS230 LG6 55 l ( ;巳U八C(G( Ti(CC(:TIiC R, TCC(;(;TGITGITIATGT( :iAC正NY / T 3752-2020 表1(续)编勺引物名称i锁l作i且火山山,C号|物)(-列(5-:)SFP26 H 八2605LG8 F,C;AGATrAC八Al八IG八CA55 R, GTCnGAAA ;TAGTIG(;TrG
14、巳SFP27 URSIO G7 IJ;IO lCCICAACIAATGCTGTCC1GArG 55 R.TCGG八lATGATl;CTGl TAAACGl SIP28 OR5853 LG10 F. TGCTrATrGACC;T IACCCATrc; 55 R. TrC;rrAAGGCTCTTl;CTA八rC;AASFP2!) 0日S:541.(;11( 15 F. AAATITICTICTC八AATGAACCTC55 R, TTATlA!巳CATC;AC(;ATCSFP:lO Hi3073 1.(;12 F.GAGTCA八nc;cl寸GTATC;55 R. GCiCTGAAACATTiGCAT
15、C SFP31 。RSI086LGI4 l八nArCGGCACArCITGGiTr-I55 I .1Tl ;lTrc;T仁GCA巳ACrCi八GATISFP32 S5L003 I.G11 F.CACiACC1Tncncrl;CTI巳L55 R .GAl;TCTCAlTI,;八GCCCACl日1133OR日IIILGI7 F. Ac(;iATl ;AAATGGl ;TC;Tl;TGl 55 R. CC1TCTCCTCA八 rCITIU;CTi5113.1 S51.171 lICTG i iCTl;G A;C iTl ;CG AC 55 R. TC;CAAiGAAGAiGAAGTGl;iGA 注丰
16、古rjr31对引物主要参.thc Sunflnwcr cM叩J)illilbascI叫主j(http;/sunf1owcr.uga.cdu/CTnilp/) 囚6. 3. 2 ,j,1I 点实.1 : !JiTI:允|采川j于21方式,可以先采J1IJI物SFPOI-SI、110迸行检测.拌检测主IJnf以知|不衍生Jf梨的差异位点数的,可终11,.检测。注:采用前10刘JI!jj)未达到可以判定不rlii*fl差异位,J.数的,则继续完成IJI物SFPI1-SFP20 I检测,以此类Ho也可卫l接采用农1n, 34 X.j SSR引物.ilt行检测。6.3.3 品种;j;二tl二身份鉴定公布
17、具备已):11品种SSRJ甘纹数据比1、l平台的前捉下,通过构边供检样品的衍纹,手IJJTJ SSI JI1纹数据11比川平台能够筛查确立i二至具体ITJI种。检测lI.j;UfJ表l的31)(、jSSR引物.ilth将测,与SSRJ旨纹数据比对平台比较筛查与试验样品指纹宜的1日,种。6. 4样品6 4. 1送恙j峻j脸贵价中样f丰刮制L弘阳lJht1lH山lE耍t卢求6. 4. 2 试验中品应至少含有30个个体,叮以混合检测或单个个体检测。7 仪器设备、试剂和溶液配制7.1 仪器设备7. 1. 1 DNA提取高速冷冻RI心十L7l浴俐或金属浴、紫外分光光度计、酸l主d、组织耐f踏仪。7. 1
18、. 2 PCR扩增p气气C千J贝:7. 1. 3电i泳示7. 1. 3. 1 毛细管电泳检测平台iiS传分析仪。7. 1.3.2 变性PAGE垂直板电泳,jFf.:Ib.泳仪、垂直极1:1泳糟及配套的制J&附刊、水平在iJ;辰、胶片观察们、数码相机或凝l段成象系统。7.1.4 其他器具微盐移液n、电子天王、r:-:lJk灭菌锅、 1磁力搅拌圳、冰箱、染色盒、制冰机、赵纯7l仪等。4 NY / T 3752-2020 7.2试剂7. 2. 1 DNA提取CTAB、SDS、=:.;JI11炕、异戊醉、乙二版四乙酸二俐(EDT-Na,.2H,()、气后IP 1击氨基啡l饶了Jrisbase)、.!i
19、ktW、氢氧化制、化销、无水乙廓。7. 2 2 PCR扩增dNTP队TaqfiIj、10X绥l液、ddH, (), 71物或者2XTaq Mix 昆合液。7.23 电泳7. 2 3 1 毛细管电泳与使用的ili传分析仪,IJ.扑IID7.2.3.2 变性PAGE垂直板电泳1号离子rp1II:)胶(Formami 1le)、丙烯毗!胶(AcrylamidJ):-.J八分子封标lfJ、无水倒、-:1于111基氨基ITJ炕7. 3 溶液配串1)DNA JJtjf、试剂配jlill所求的水。8 检测程序1顿份1民匀。JO min,在J20 Nft:li: 10 min.征2j ,充分混合后i(1jl
20、Z只1m冷的无水乙nj!.,- 100 ng/1, ,世二r4C备8. 1. 2 SDS 法丰沂栩1;诩-忧试附附附验附帆帆帆阳阳杆样轨州附圳一寸J川品州仙lA肝品川阳l罚M阳7古刊川,-:J;功芦为划川肌j川此州阳!胚肌肌赃阴凹川升芽坏川川川川eJ州圳、M均圳圳U幼阳圳圳圳叫j川川川川刷Ji川的阳If市峨呻呻t丁闯If!1I啤耐耐或如圳IIJ2. 0 m、讨L(内的|内甘1离z苟l心岱I中j卡1:过;!J11人65Cl- . 画. 圃、i包泳缓l液曰丙烯/克服(Bisacrylam 他炕(RcpelSilane)、IPiW、主氧化合j吕iYft J吃罗充分混合后忡本积的;JI样,rdr7-J
21、利子,将向H葵种子:(1二liJf钵中j,li丰.转入2.0mL离心斗,.,, J JI1入50C预热的0.5%的SDS挝取液7001L,昆匀,10min)击力11入711蛋白内f1, 50C水i浴50ml、, 1fl0min轻轻拯动li匀。衍!比51、幼由 和IIt)或中l 子的DN八t;lJlX在水浴结束盯冷却l至2主n,it,创节1110人字体积的=刽IJl炕/异J义归作(24 1)混合IlU,充分混合!可mtII10 min.1 2 000 r/ min 1萄心10minQ吸收U.液转移至新的Tk心售巾,川人匀体积的主i.lfiJ.充分混合后仰:,:10 min.1 2 0r/min
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