GB∕T 40252-2021 美澳型核果褐腐病菌活性检测方法.pdf
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1、ICS 65.020.01 CCS B 16 中华人民共和国国家标准GB/T 40252-2021 美澳型核果褐腐病菌活性检测方法Viability test of Monilinifruticol(G. Winter) Honey 2021-05-21发布国家市场监督管理总局Lg.-/;-国家标准化管理委员会以叩2021-12-01实施G/T 40252-2021 目。吕本文件按照GB/T1. 1-2020标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC2
2、71)提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国深圳海关、深圳市检验检疫科学研究院、深圳市仙湖植物园。本文件主要起草人:章桂明、王颖、高瑞芳、程颖慧、朱子钦、李娜、黄河清、刘莹。I G/T 40252-2021 美澳型核果褐腐病菌活性检测方法1 范围本文件描述了应用普通荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜对美澳型核果褐腐病菌Moniliniafuticola C G. Winter) HoneyJ进行活性检测的方法。本文件适用于美澳型核果褐腐病菌相关寄主中携带美澳型核果褐腐病菌的分生于包子活性检测。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用
3、文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/ T 2589 植物病原真菌检测规范3 术语和定义3.1 3.2 下列术语和定义适用于本文件。i舌性viability具有生命力的一种性质。分生于包子活性conidial viabliity 分生于包子具有生命力的一种性质。注:分生抱子具有活性,说明分生抱子是活的;分生抱子不具有活性,说明分生抱子是死的。4 基本信息中文名:美澳型核果褐腐病菌英文名:pathogen of American brown rot of stone fruit 学名:Moniliniafucticola CG
4、. Winter) Honey 曾用名:Sclerotinia j叩cticolaC Winter) Rehm. 无性态:Monilia f.ucticola Batra 分类地位:属真菌界CFungi),子囊菌门CAscomycota)子囊菌纲CAscomycetes) ,柔膜菌目CHelotia les) ,核盘菌科CSclerotiniaceae) ,链核盘菌属CMonilinia)。美澳型核果褐腐病菌寄主、症状、菌落特征及分生于包子形态学特征见附录A。5 原理分别应用二乙酸荧光素CFlouresceinDiacetate,FDA)和腆化丙皖CPropidiumIodide, PD荧光染
5、料G/T 40252-2021 对美澳型核果褐腐病菌子包子进行染色处理,根据FDA可通过细胞代谢留在活细胞内,使具有活性的子包子发出绿色荧光,如果细胞膜损伤,则荧光素流失,因而使不具有活性的抱子不发出荧光;PI能够穿透正在死亡或者已经死亡的细胞膜,使不具活性的抱子发出红色荧光,PI不能透过具有活力的细胞膜,使具有活性的抱子不发出荧光。根据上述特点并运用普通荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜对病菌分生抱子进行活性检测,分析分生抱子的死活。6 仪器和试剂6.1 仪器用具普通荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜、超净级工作台、天平、高压灭菌锅、生化培养箱、冰箱、离心机。6.2 试剂二乙酸荧光素CFlour
6、esceinDiacetate, FDA) :称取0.1g FDA粉末,加入10mL丙酬,配制成浓度为10mg mL-1的母液,置于棕色瓶4oc避光保存。使用前用丙酬稀释,配置成0.5mg mL-1的工作液。腆化丙昵CPropidiumIodide,PD:称取0.01g PI粉末,加入10mL无菌水,配制成浓度为1mg. mL一1的母液,置于棕色瓶4oc避光保存,使用前用无菌水稀释,配置成0.05mg mL-的工作液。6.3 主要培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基CPDA): 200 g去皮马铃薯切成小方块,加人1000 mL自来水,煮沸15 mi口,用四层纱布过滤得到滤液,滤液中加入18g葡萄糖、
7、18g琼脂粉,加热溶解后将溶液定容至1 000 mL,分装到三角瓶中,121oc高压蒸汽灭菌20min。7 活性检测方法7.1 检测样晶制备刮取奇主症状病征的分生于包子装入到有无菌水的离心管中,配制成终浓度为每微升含10个100个子包子的子包子悬浮液,镜检,备用。7.2 抱子染色7.2.1 FDA染色取199Lj包子悬浮液,加入1L质量浓度为0.5mg mL-的FDA,混匀,于室温下避光染色15 min,16 000 g离心1min,弃上清液终止染色,加入灭菌去离子水洗涤一次,重新悬浮。现配现用,避光放置。7.2.2 PI染色取199Lj包子悬浮液,加入1L质量浓度为0.05mg mL一1的凹
8、,混匀,于室温下避光染色4 mi口,16000 g离心1min弃上清液终止染色,加灭菌去离子水洗涤一次,重新悬浮。现配现用,避光放置。2 7.3 普通荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜活性检测7.3.1 普通荧光显微镜检测7.3.1.1 制片吸取5L活性染料处理之后的样品制备玻片,封片。7.3.1.2 检测G/T 40252-2021 将制好的破片立即放置于普通荧光显微镜载物台上,在低倍镜下找到子包子,然后转至40倍镜下观察,微调至视野内图像清晰下观察并计数。至少检测30个子包子,观察染色情况。FDA染色检测:将荧光光路打开,设置荧光通道的激发波长488日m,收集荧光信号的发射波长530 nm,
9、收集荧光信号。微调至视野内图像清晰。(见附录B)PI染色检测:将荧光光路打开,设置荧光通道的激发波长534nm,收集荧光信号的发射波长617 nm,收集荧光信号。微调至视野内图像清晰。(见附录B)注:为了保证图像能够反映出于包子最真实的荧光染色情况,特别需要观察明场通道下所得到砸子图像是否清晰。7.3.2 激光扫描共聚焦显微镜活性检测7.3.2.1 制片吸取5L活性染料处理之后的样品制备玻片,封片。7.3.2.2 激光设置选择相应的激光管(氧离子激光器)激发荧光信号,FDA检测设置荧光通道的激发波长(488nm), 收集荧光信号的发射波长(530nm),并设置一个明场通道作为对照。PI检测设置
10、荧光通道的激发波长(534 nm),收集荧光信号的发射波长(617nm),并设置一个明场通道作为对照。7.3.2.3 扫描设置选择低像素扫描模式扫描(XY:512 X 512),重复扫描次数Average为1次,扫描速度Speed为9,根据成像效果调整探测针孔Pinhole、光电倍增管增益Gain和激光扫描强度ScanStr等参数,将图像调整至质量较好的效果。再用精确扫描方式(xy:2048X2 048)然后根据信噪比调整扫描模式,选择精确像素的平面扫描方式进行粗略扫描(xy:2048X2 048),重复扫描次数Average为2次,扫描速度Speed为6,获取最终图像。7.3.2.4 检测将
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