DB53∕T 1082-2022 高粱花叶病毒RT-PCR检测技术规程(云南省).pdf
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1、ICS65.020CCS B 1553云南省地方标准DB53/T 10822022高粱花叶病毒 RT-PCR 检测技术规程2022 - 05 - 20 发布2022 - 08 - 20 实施云南省市场监督管理局发 布DB53/T 10822022I前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由云南省农业科学院甘蔗研究所提出。本文件由云南省农业标准化技术委员会(YNTC 07)归口。本文件起草单位:云南省农业科学院甘蔗研究所。本文件主要起草人:李婕、黄应昆、单红
2、丽、王晓燕、张荣跃、仓晓燕、王长秘、尹炯、罗志明。DB53/T 108220221高粱花叶病毒 RT-PCR 检测技术规程1范围本文件规定了高粱花叶病毒RT-PCR检测方法中涉及的仪器与耗材、 试剂、 检测样品的取样及对照设置、检测方法和结果判定等。本文件适用于高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)侵染的植物样品的RT-PCR检测。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1高粱花叶病毒 Sorghum mosaic virus高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)属于马铃薯Y病毒科(Potyv
3、iridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus),是引起甘蔗花叶病的主要病毒之一,英文名称为Sorghum mosaic virus,缩写为SrMV,参见附录A。3.2RT-PCR反转录聚合酶链式反应(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)的简称,是一种在体外利用反转录酶将RNA反转录为cDNA,再以cDNA为模板进行PCR扩增,以获得RNA特定片段。4仪器与耗材4.1仪器主要仪器包含电子天平、恒温水浴锅、高速台式冷冻离心机、蛋白/核酸分析仪、PCR扩增仪、涡旋混匀器、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、可调微量移液
4、器、研钵等。4.2耗材无核酸酶(Nuclease-free)的1.5mL和2.0 mL离心管及0.2 mL PCR管等。5试剂5.1常规试剂液氮、焦碳酸二乙酯(DEPC)灭菌水或者RNase-free水、植物总RNA提取试剂盒、三氯甲烷、70%乙醇、异丙醇、无水乙醇等。DB53/T 1082202225.2RT-PCR 试剂Oligo (dT)18引物(0.5 g/L),RT-PCR反转录试剂盒,含溴酚蓝染料的2EasyTaq PCR SuperMix聚合酶混合物。5.3引物5.3.1上游引物SrMV-F:5-CATCARGCAGGRGGCGGYAC-3,下游引物SrMV-R:5-TTTCAT
5、CTGCATGTGGGCCTC-3(R=A/G,Y=C/T)。5.3.2用无核酸酶的水将上、下游引物分别配制成浓度为 20M 的水溶液。5.3.3目的扩增片段约为 820 bp。5.4电泳缓冲液的配制按以下步骤配制电泳缓冲液:a)称取 242 g 的 Tris,先用 300 mL 的 ddH2O 搅拌溶解后,加 100 mL 0.5 mol/L 的 EDTA 水溶液配制 50TAE 储存液;b)用 ddH2O 将储存液稀释 50倍配制 1TAE 工作液;c)称取 Tris108 g、硼酸 55g、7.44 g 的 Na2EDTA2H2O,加入 40 mL 0.5 mol/L 的 EDTA 水溶
6、液,再用 ddH2O 定容至 1 000 mL 配制 10TBE 储存液;d)用 ddH2O 将储存液稀释 20倍配制 0.5TBE 工作液。5.5扩增产物电泳检测试剂1%左右(W/V)琼脂糖,核酸染料。6检测样品的取样及对照设置6.1阳性对照以SrMV侵染的植物样品作为阳性对照。6.2阴性对照以健康植物样品作为阴性对照。6.3空白对照以灭菌ddH2O作为空白对照。6.4取样戴一次性手套采集甘蔗叶片或芽作为待检样品, 且每采一个样品跟换一次手套, 过程中不应交叉污染。将采的集样品放入自封袋中,编号,冷藏运输到实验室液氮速冻后,于-80 冰箱保存备用。7检测方法7.1总 RNA 提取总RNA提取
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