NY∕T 3308-2018 动物皮张源性成分鉴定 实时荧光定性PCR法(农业).pdf
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1、ICS 59.140.20 B 45 NY 中华人民共和国农业行业标准动物皮张源性成分鉴定实时荧光定性PCR法NY/ T 3308一2018Identification of animal-derived materials in leather一Qualitative realtime PCR method 2018-12-19发布2019-06-01实施 吁., 中华人民共和国农业农村部发布 1、目。吕木标准按照GB/T1. 1-2009给山的规则起草。本标准由农业农村部畜牧兽医局提tLl0 本标准由全国畜牧业标月l千七技术委员会(SAC/TC274)归口。本标准起草单位,山东省农业科学院
2、生物技术研究中心。NY/T 3308-2018 本标准主要起草人步迅、范阳阳、文1J艳艳、张全芳、胡悦、谷玉假、马德源、李F挝、杨雪、部IIljIIj!j一、陈写燕、刘国政、王兴军。T NY/T 3308-2018 动物皮张源性成分鉴定实时荧光定性PCR法范围本标准规定了利用实时荧光定性PCR法对水貌、狐狸、兔、牛(普通牛、黄牛)、马、猪、羊(绵羊、山羊)、貌子和l家犬9种动物皮张源性成分进行位副本标fl适用于动物皮张及初加rc圈圈圈脑、黄牛)、马、猪、羊绵羊、山羊)、箱子和家犬9本方法检:11限为1%。2 规范性引用文件3 3.1 3. 2 实时荧在PCR4 原理根据线粒体16S 采用Taq
3、Man实时荧光狸、兔、牛(普通牛、黄牛、马5 试剂或材料除另有规定外,仅使用分析纯试剂.5. 1 水, GB/T6682,一级.5. 2 1 mol/L Tris - HCI(pH 8.0)溶液称取12.1 g Tris笠于100mL烧杯中,加入80mL水,用浓HCI调节pH至8.0,jJfl水定容至100mL,103. 4 kPa C121.C)灭菌20min,室温保存待用.5.3 1 mol/L Tris - HCI(pH 6.4)浴液称i驭12.1 g Tris it于100mL烧杯中,1JlI入80mL 水,月2浓HCI调节pl-I至6.4,加水定容至100mL, 103. 4 kPa
4、 蒸汽压C121.C)灭ff20 min,室温保存待用。5.4 0. 5 mol/L EDTA(pH 8.0)浴液:称取18.61g Na,EDTA 2H,O ii于100mL烧柯中,如l入80mL水,用10%lfJNaOH浴液,调节pH至8.0,jJU水定容至100mL,商店,灭菌后室温保存待用.NY/T 3308- 2018 5.5 10%十二锐lili硫股钊(SOS),称垠10g SOS浴解于80mL元菌水中.!JJI水定容至100mL。储存于灭在i过的容然中待用。5. 6 5 mol/ L NaCI浴液:称Jll(29. 22 g NaCI浴解于80mL无菌水中,力117Jc定容至10
5、0mL.在103.4kPa 蒸汽庇(121.C)条件下灭菌20min,室源保存待用.5 7 细胞裂解被(LysisBuffcr) ,J仅1mol/ L Tris -l-ICI(pH 8.0)溶液20mL. O . 5 mol/L EOT八(1l-I 8.0)溶液5mL. 5. 0 mol/ L NaCI溶液10mL.I0% SOS浴?在5mL.IJJI水定容至100mL.很匀。5. 8 20 mg/mL蛋臼酶K浴液稍量。.2 g蛋白酶冻干品,如l水浴解.lm水定容至10mL.分装后于一20.C保存。5. 9 RN八隅溶液将1g 1;东干品RNA酶A浴解于6mL元f水中,于100.C力II热15
6、mio,缓慢冷却l至室洞.110水定容至10mL.分马克成小份存于20.C。5. 10 硅珠悬浮液,J仅5g的磁j庇力u入到20mL的水中充分混合,ff.ft止24h.弃掉上消液,再加入20mL的水中充分混合.1ll:ifft止5h.弃去上活液。在沉淀的破珠中力II人5mL的水,再IJJI人5L的浓盐酸,充分混合,调节pH至2.0.5 11 ONA结合液(indingBuffcr) ,称取60g异硫低自主/JIll(GUSCN).IJl1入5mL 1 mol/ L Tris -l-ICI (11-16.4)溶液,再加入8mL O . 5 mol/ L EOTAp!-! 8.0)浴液,再加入4m
7、L聚乙二醉辛基苯基隧(Trition X -100) (温度60.C).lm水定容至100mL。5. 12 襟洗液(WashingBuffcr),称取60g异。E现股/JIll(GUSCN).力JI入5mL 1 mol/ L Tris!-!CI(pI-l 6.4)浴液,再加入8mL O . 5 mol/ L EOTA(p!-! 8. 0) .lm水定容至100rr止。5.13 70%乙j:,盘i仅70mL乙醉,加入30mL水。5. 14 TE缓冲液:将0.5mL的10mmol Tris -l-ICI( pl-I 8.0)溶液、0.1mL的0.5mol/ L EOTA(pl-! 8.0)济液加入
8、到50mL容量瓶中,调pI-l8. O. IJl1水定容.103.4kPa蒸汽压021.C)灭菌20min,降至室泪.4.C保存备用。5. 15 水貌、狐狸、兔、牛(普通牛、黄牛)、马、狗、羊(绵羊、山羊)、稳子和家犬9利5动物源性成分实时荧光PCR定性检测试剂盒试剂,2X TaqManMastcr Mix.含有TaqONA聚合酶(终浓度1U/20L)、Mg2+ (终浓度2.0mmol/L)、dNTPs(终浓度0.2mmol/L). 7j(貌、狐狸、兔、牛(普通牛、黄牛)、马、猪、羊(绵羊、山羊)、秘子和家犬9种动物i),?i1lili1组织ONA附|尘标I!品。6 仪器设备6 1 实时荧光定
9、盐PCR仪:4逍遥以上。6. 2 紫外分光光!且计.彼伏190nm900 nm 6. 3 电子分析天平:感量:O . 1 mg. 6. 4 ll心机:最大转速13000g。6. 5 振荡型恒Ml金属浴,O.C 100.C. 6.6 高Jf.灭菌锅.6. 7 低?1Wl冰箱:一20.C4.C.6. 8 超净工作台.6. 9 微盘移液然,100L1000L.I0L200L.2L20L. 0.5L10L。7 检测用引物和探针内参引物探钊序列及水貌、狐狸、兔、牛(普通牛、黄牛)、马、猪、羊(绵羊、山羊)、秘子和家犬9和liYJ物的通用引物和特异性探针序列见附录A中的表A.L引物探针在f.列中的位551
10、参见附录B.NY!T 3308一2018B 试验步骤8 1 取样在盐干皮或草草制j皮张的平整边缘处i驭约4cm2大小试样,去除毛和脂肪,在无囱水中浸泡20min, 用无菌水清洗2次,将试样剪成直径约5mm小块,使用液氮jj)f磨成粉末。8.2 DNA提取称i驭30mg样JTI装入2mL的离心管中,每个样品设立2个平行样,加入400L的DNA提取封I1JJ包裂解液(5.7),10J.LL蛋白酶K浴液(5.8江旦二二乙二h,期可不时轻微摇匀。12000g,离心5 min,1础上清晰#至新的l.Sm与.-匾hb-(S.10) -!JU 800L DNA结合液(S.l1),充分混匀室温静置5骗.-.酬
11、冒Tt鄂嗖哩圄凰L漂洗液(S.12),涡旋振荡邸,8000g乱,lm同斗7Bol: f_百OOg离心1min础上消液,重复此步骤2次;. 胃L也M路命骗他1ffi,如胃-除乙醉完全挥发,1m入8. 3 ) 身怡hu户、注每个PCR反应8.3. 3 实时荧光PCRPCR反应毡中,如l入模板DN八,38.3. 4 实时荧光PCR反应程序95C预变性3min;9SC变性10s, 60C退火延fll35 s(收集荧光信号),40个循环。9 试验数据处理9. 1 对照检测结果分析空白对!R、阴性对照和阳性对!自全部满足下述条件,表明PCR体系有效a) 空白对!,A、B、C、D4组PCR体系对应的反应孔均
12、无FAMJ OE、ROX军11CY5荧光的典型扩增i出线;b) 阴性对!自,A、B、C、D4组PCR体系对应的反应孔均无FAM,JOE、ROX荧光的典型扩均1111NY!T 3308-2018 线;而iCY5有典型扩增1111线,且Ct值35.0;c) 阳性对!照A、B、C、04组PCR体系对应(jj反应孔中均tU现FAM,OE、ROX和CY5荧光的典型扩增Itu线,且Ct值35.0.9 2 试样检测结果分析和表述9.2 1 在PCR反应体系有效且内参基l刻11:1现典型扩增IUl线(Ct值35.0)的情况下,当有FAM,OE、CY3荧光典型扩增Iltl线出现,若Ct值35.O.则判定样品中检
13、I.B相应的动物源性成分;若无典型扩圳1111线,则判定样品中未检:相应的Z;!J物iJjj(性成分。9.22 在PCR反应体系有效且内参基|划出现典型扩增IUl线(Ct值35.0)的情况下,当有FAM,JOE、CY3荧光典型扩增1111线出现,但35.0Ct值40.O.则需要重新提取ON八加大棋板量进行PCR反应.若再次书增后的Ct值35多重PCR+ 检山狐狸源性成分未检:1:狐狸源性成分或宫最低体系八于检测限多重PCR+ 检11:猪W-性成分未检:1:J:由ilfi.性成分或含古i低于体系B检测限多茧PCR+ 检t1l箱子说性成分术检出哥?子W-性成分或含1,1低f牛系C于检测限多重PCR
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