Elisa技术原理及应用PPT课件.pptx

Elisa原理及应用简介(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay)启因生物日期：2017-08-182024/3/9 周六1Elisa发展Elisa原理常用检测方法应用前景2024/3/9 周六2ELISA的的发展展ELISA是酶联接免疫吸附剂测定(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay)的简称。其是继免疫荧光（IFA）和放射性免疫（RIA）分析技术之后，建立起来的用酶来标记抗原或抗体的分析技术。自上世纪70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。2024/3/9 周六3ELISA的原理的原理定义：以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种检测未知抗体或抗原的敏感性很高的试验技术。反应的基础：l抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记（结合在固相载体的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，而酶标记的抗原或抗体既保持其免疫学活性又保留酶的活性）；l加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。2024/3/9 周六4ELISA的原理的原理抗原抗原l定义：抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质。抗原进入机体后，可刺激机体引起细胞免疫和产生抗体。l能在机体中引起抗体产生的抗原多为分子量大于5000的蛋白质，例如完整的病毒粒子、细菌等；l小分子化合物在与大分子蛋白质结合后能引起机体产生特异性抗体的，称为半抗原；例如某些激素、药物等。l抗原的反应性取决于抗原决定簇，或称为表位。一个抗原分子可带有不同的决定簇，例如细菌的荚膜多糖、类脂中可带有多个抗原决定簇。2024/3/9 周六5ELISA的原理的原理抗体抗体定义：抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(Ig)，Ig分五类即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。Ig由两个轻链L和两个重链H的单体组成。Ig的轻链是相同的，有和两种型别，五类Ig的重链结构不同，这决定了它们的抗原性也不同。特点:l可逆性：抗原抗体的结合是动态平衡过程；l特异性：抗原抗体化学结构互补，高度特异；l最适比例；抗原抗体的含量应保持最适合的比例；l敏感性：标记的免疫敏感度可达ng/ml2024/3/9 周六6ELISA的原理的原理ELISA方法中三个必要的方法中三个必要的试剂固相的抗原或抗体，即固相的抗原或抗体，即免疫吸附免疫吸附剂（immunosorbent）；）；酶标记的抗原或抗体，称的抗原或抗体，称为结合物合物（conjugate）；）；酶反反应的底物。的底物。可可设计出各种不同出各种不同类型的型的检测方法。方法。2024/3/9 周六7ELISA的的检测类型型固相载体具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。聚苯乙烯ELISA 反应中最常用的固相载体，具有较强的吸附蛋白质的性能。在ELISA测定过程中，它作为载体和容器，不参与化学反应。抗原、抗体和其它生物分子通过多种机制吸附至载体表面，这包括通过疏水键、流水/离子键的被动吸附,通过引入其它活性基团如氨基和碳基的共价结合，以及通过表面改性后的亲水键结合。聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。固相固相载体体2024/3/9 周六8ELISA的的检测类型型 概念：概念：将将抗原或抗体固定抗原或抗体固定在固相在固相载体的体的过程程称称为包被包被(coating)。蛋白蛋白质与聚苯乙与聚苯乙烯固相固相载体是通体是通过物理吸附物理吸附结合的，靠的是蛋白合的，靠的是蛋白质分子分子结构上的疏水基构上的疏水基团与固相与固相载体表面的疏水基体表面的疏水基团间的作用。的作用。这种物理吸附种物理吸附是非特异性的，受蛋白是非特异性的，受蛋白质的分子量、等的分子量、等电点、点、浓度等的影响。大分子蛋度等的影响。大分子蛋白白质较小分子蛋白小分子蛋白质通常含有更多的通常含有更多的疏水基疏水基团，故更易吸附到固相，故更易吸附到固相载体体表面。表面。包被的方式包被的方式2024/3/9 周六9ELISA的的检测类型型ELISA常用常用酶2024/3/9 周六10ELISA的的检测类型型包被包被目的目的抗体抗体加受检标本（抗原）形成加受检标本（抗原）形成固相抗体抗原复合物固相抗体抗原复合物 洗涤除去未结洗涤除去未结合的其他物质合的其他物质 加加酶标抗体酶标抗体生成生成抗体抗体-待测抗原待测抗原-酶标记抗体酶标记抗体的复合物的复合物 彻底洗涤未结彻底洗涤未结合的酶标抗体合的酶标抗体 加底物进行加底物进行酶催化反应酶催化反应 根据颜色反应的根据颜色反应的程度进行抗原的程度进行抗原的定性或定量测定定性或定量测定实验基本流程基本流程图2024/3/9 周六11ELISA的的检测类型型l双抗双抗夹心法：心法：双抗体双抗体夹心法心法测抗原抗原和双抗原和双抗原夹心法心法测抗体抗体l间接法接法测抗体（常用）抗体（常用）l竞争法：争法：竞争法争法测抗原与抗原与竞争法争法测抗体抗体l捕捕获包被法包被法测抗体抗体l亲和素和素生物素生物素 ELISA法法2024/3/9 周六12ELISA的的检测类型型双抗体双抗体夹心法心法测抗原抗原特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体；标本中的抗原与固相载体上的抗体结合成固相抗原复合物；加酶标记抗体，使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合，酶量与标本中受检物质的量成正相关。加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量2024/3/9 周六13ELISA的的检测类型型双抗原双抗原夹心法心法测抗体抗体 用特异性抗原用特异性抗原进行包被和制行包被和制备酶结合物。此法中受合物。此法中受检标本本不需稀不需稀释，可直接用于，可直接用于测定，因此其敏感度相定，因此其敏感度相对高于高于间接接法。乙肝法。乙肝标志物中抗志物中抗HBsAg的的检测常采用本法。本法关常采用本法。本法关键在于在于酶标抗原的制抗原的制备，应根据抗原根据抗原结构的不同，构的不同，寻找合适找合适的的标记方法。方法。2024/3/9 周六142024/3/9 周六15ELISA的的检测类型型间接法接法测抗体抗体酶标二抗酶标二抗底物底物间接法是检测抗体常用的方法，其原理为利用酶标记的二抗（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。其其检测方法：固相方法：固相(包被包被)抗原抗原Ag+样品品(抗体抗体Ab)+酶标二抗二抗Ab*Ag-Ab-抗抗Ab*+底物底物(TMB)显色色2024/3/9 周六16ELISA的的检测类型型竞争法争法测抗体抗体原理:标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应：固相固相(包被包被)抗原抗原Ag+样品品(抗体抗体Ab)+酶标抗体抗体Ab*Ag-Ab+底物底物(TMB)不不显色色(+)固相固相(包被包被)抗原抗原Ag+样品品(无抗体无抗体Ab)+酶标抗体抗体Ab*Ag-Ab*+底物底物(TMB)显色色(-)2024/3/9 周六17ABS-ELISA法法ELISA的的检测类型型：固相支持物；：固相支持物；：样品；品；：特异性：特异性IgG；：生物素化抗小鼠：生物素化抗小鼠IgG（Biotin）；）；：辣根：辣根过氧化物氧化物酶HRP-酶标链亲和素（和素（Avidin）；）；：DAB显色液；色液；：显色；色；ABS:亲和素（avidin）生物素（biotin）系统（system）亲和素与生物素的结合，虽不属于免疫反应，但特异性强，亲和力大，能够形成一种极为稳定的复合体。把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，可以大大提高ELISA的敏感度。2024/3/9 周六18ELISA检测ELISA特点：特点：灵敏度高：灵敏度高：ELISA测定法的灵敏度来自作定法的灵敏度来自作为报告基告基团的的酶。由于。由于酶的的催化效率很高，很少量的催化效率很高，很少量的酶即可即可诱导大量的催化反大量的催化反应，产生可供生可供观察的察的显色反色反应，间接地放大了免疫反接地放大了免疫反应的的结果，使果，使测定方法达到很高的敏感定方法达到很高的敏感度。度。特异性特异性强：ELISA的特异性来自抗体或抗原的的特异性来自抗体或抗原的选择性。抗原抗体的性。抗原抗体的结合合实质上只上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之合位点之间。由于。由于两者在化学两者在化学结构和空构和空间构型上呈互构型上呈互补关系，所以抗原抗体反关系，所以抗原抗体反应具有高度具有高度的的特异性。特异性。准确性高、准确性高、检测时间短、价格低廉、判断短、价格低廉、判断结果有客果有客观标准、准、结果便于果便于记录和保存等和保存等优点，适合于大批点，适合于大批标本的本的检测，广泛，广泛应用于食品安全用于食品安全检测、医医疗检测以及免疫以及免疫实验分析等分析等领域。域。2024/3/9 周六19ELISA应用前景用前景免疫免疫酶染色各种染色各种细胞内成份的定位胞内成份的定位 研究抗研究抗酶抗体的合成抗体的合成显现微量的免疫沉淀反微量的免疫沉淀反应定量定量检测体液中抗原或抗体成份体液中抗原或抗体成份 ELISA在生物医学在生物医学领域域的的应用用范范围四四个方面：个方面：2024/3/9 周六20ELISA应用前景用前景ELISA在在检测抗原方面：抗原方面：在实际应用方面：可作疾病的临床诊断、疾病监察、疾病普查、法医检查、兽医及农业上的植物病害的诊断检定等。检查抗原和半抗原方面：在内分泌方面用于检测雌性激素、绒毛膜促性腺激素、黄体素、胰岛素、皮质醇、促甲状腺素和孕酮等在血液学方面：可用于检查凝固因子（如第凝固因子）、红细胞抗原及结合球蛋白（Hapto Globin）等在肿瘤方面：试用检查甲胎蛋白（AFP）癌胚抗原（CEA），对前者的敏感性已达到与放射免疫试验相当的水平，但对CEA检查的敏感性较低，目前尚不能用于常规诊断在传染病的诊断方面：用于检查乙型肝炎表面抗原。其他方面：尚有用于检查霍乱弧菌、大肠肝菌、绿脓杆菌和破伤风梭菌毒素；脑膜炎球菌及淋球菌抗原；检查免疫抑制病人中常见的白色念殊菌抗原，检查病人或病兽的粪便中的轮状病毒，自病人标本中检查甲肝病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、流感、呼吸道融合及巨细胞病毒等2024/3/9 周六21ELISA应用前景用前景ELISA在在检测抗体方面：抗体方面：寄生虫病方面：用于对疟原虫、阿米巴、利日曼原虫、锥虫、血吸虫、囊虫、弓浆虫、肺吸虫、肝吸虫、血丝虫、旋毛虫病等血清学诊断，这对人医和兽医都很重要。病原微生物方面：已用于检查链球菌、沙门氏菌、布氏杆菌、结核杆菌、麻疯杆菌、霍乱弧菌、淋球菌、假丝酵母菌等的抗体，还可用于破伤风抗毒素和霍乱弧菌抗毒素的测定以及检测斑疹伤寒立克次氏体感染后的抗体，可作诊断。试用于病毒抗体检查报告的有：流感病毒、腮腺炎病毒、麻诊、风疹、轮状病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒、腺病毒、肠道病毒、脑炎病毒、黄热病毒、狂犬病毒和脊髓灰质炎病毒等，其敏感性都超过目前常用的检查方法。卫生学方面：可用于检测食品中葡萄球菌肠毒素及沙门氏菌毒素等等。2024/3/9 周六22样品类型：血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清、组织匀浆等。种属：人检测周期：收到样品起一周内。公司公司检测类型型 费用：ELISA检测25元/样；实验方法：只需提供样品，数量不限。按照样品数目实际使用孔数计算费用实验结果：原始OD值，标准曲线，目的样品基因检测含量2024/3/9 周六23公司公司产品品 2024/3/9 周六24公司公司产品品 2024/3/9 周六25公司公司产品品 2024/3/9 周六26 THANKS!2024/3/9 周六272024/3/9 周六28