第二章核酸学生.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第 二 章,核 酸,CHEMISTRY OF,NUCLEIC ACID,核酸与蛋白质一样，是一切生物机体不可缺少的组成部分。,核酸是生命遗传信息的携带者和传递者，它不仅对于生命的延续，生物物种遗传特性的保持，生长发育，细胞分化等起着重要的作用，而且与生物变异，如肿瘤、遗传病、代谢病等也密切相关。,因此，核酸是现代生物化学、分子生物学和医学的重要基础之一。,核酸概述,（一）核酸的发展史,1.1869年,瑞士年轻的医生Friedrich Miescher 在废弃的外科绷带上的血细胞核中分离到一种物质，含有高比例的磷，他将其命名为“核素”（nuclein）。,后来，发现有强烈的酸性，改名为“核酸”（nucleic acid）。虽然Miescher并不知道，但他发现了DNA！,2.不久，,Hoppe-Seyler 从酵母细胞中分离了类似的物质，现在知道是RNA。,3.20世纪50年代以前，“四核苷酸假说”比较流行，但缺乏结构方面的多样性，因此普遍认为核酸不大可能有重要的生理功能。,4.1943年，Chargaff等证明DNA中4种碱基的比例并不相等。,5.1944年，美国生化学家Avery通过肺炎双球菌转化实验，证实DNA是遗传物质。,6.,1953年,James Watson and Francis Crick提出了DNA的双螺旋结构模型。,（二）核酸概念,和蛋白质一样，核酸是一种重要的生物高分子化合物，是由其结构单体核苷酸通过,3,5,-磷酸二酯键聚合而成的长链，继而形成具有复杂三维结构的大分子化合物。,核酸是动物、植物、微生物机体的重要组成成分，约占细胞干重的 。,（四）核酸的重要性,1.DNA是主要遗传物质，是遗传信息的载体。,证据有：,细菌转化实验。1944年Avery 第一次证明了DNA是细菌转化的因子。,噬菌体侵染细菌实验。1952 年，Hershey 和Chase 噬菌体感染实验。,2.RNA在蛋白质生物合成中起重要作用。,肺炎球菌转化实验,III S型细胞（有毒）,II R型细胞（无毒）,破碎细胞,DNAase降解后的DNA,II R型细胞接受III S型,DNA,只有II R型,大多数仍为II R型,少数II R型细胞被转化产生III S型荚膜,S（光滑）,S,R,R,R（粗糙）,+,DNA,噬菌体侵染细菌实验,一、核酸的化学组成,核酸的元素组成:,C、H、O、N、P,其中P在各种核酸中的含量比较恒定：,RNA平均含磷量8.9%,DNA平均含磷量9.1%,核酸的逐级水解过程：,核酸酶；核苷酸酶；核苷酶,磷酸,核酸 核苷酸 戊糖,核苷,碱基,（一）戊糖,（pentose）,RNA中的戊糖为,-D-核糖（,-D-ribose）,DNA中的戊糖为-D-2-脱氧核糖(-D-2-deoxyribose),Ribose,Deoxyribose,2,1,3,4,5,2,（二）含氮碱基（氮碱）,核酸中的碱基分为两类，即嘌呤碱和嘧啶碱。两类核酸中所含的主要碱基都是4种：,1.嘌呤碱（purine）,为嘌呤的衍生物，两种：,腺嘌呤（adenine Ade or A）,鸟嘌呤（guanine Gua or G,）,嘌呤环,腺嘌呤,鸟嘌呤,N,9,是成苷位置,2.嘧啶碱（pyrimidine）,胞嘧啶 （cytosine Cyt or C）,尿嘧啶 （uracil Ura or U）,胸腺嘧啶（thymine Thy or T）,RNA中的碱基为胞嘧啶和尿嘧啶；,DNA中的碱基为胞嘧啶和胸腺,嘧啶,。,N,1,是成苷位置,1,2,3,4,5,6,pyrimidine ring system 嘧啶环,胞嘧啶,胸腺嘧啶,尿嘧啶,3.稀有碱基（修饰碱基、微量碱基）,含量甚少的碱基，多数为主要碱基的修饰物。tRNA中大约有10%。,4.碱基的结构特征,（1）结构互变,酮式,烯醇式,氨基,亚氨基,（2）嘌呤碱和嘧啶碱分子中都含有共轭双键体系，在紫外区有吸收（260 nm左右）,（三）核苷（nucleoside）,核苷是戊糖和碱基通过糖苷键形成的糖苷。,由戊糖（核糖或脱氧核糖）的第1位C碳原子与嘌呤碱的第9位N原子或嘧啶碱的第1位N原子通过N-糖苷键相连。核苷为-型，碱基平面与戊糖平面互相垂直。,核苷有两类，分别存在于RNA和DNA中：核糖核苷（ribonucleoside）脱氧核糖核苷（deoxyribonucleoside）,Adenosine Guanosine Cytidine Uridine,There are two types nucleoside,Proteins,nucleoside,Deoxynucleoside,核酸中的稀有核苷：,次黄苷（inosine,I）,假尿苷,(pseudouridine,),7-甲基鸟苷,（7-methylguanosine,m,7,G）,二氢尿嘧啶核苷,（dihydrouridine,DHU）,（四）核苷酸（nucleotide）,核苷酸是核苷的磷酸酯。在核苷酸的核糖上，有3个游离的羟基，它们磷酸化可形成2,-、3,-和5,-核苷酸。在脱氧核苷酸核糖上，有2个游离羟基，磷酸化形成3,-和5,-脱氧核苷酸。生物体游离核苷酸多为5,-核苷酸。水解核酸得到5,-核苷酸和3,-核苷酸。,O,H,H,腺嘌呤核苷酸（AMP）,Adenosine monophosphate,脱氧腺嘌呤核苷酸（dAMP）Deoxy,adenosine,monophosphate,RNA中的核苷酸有4种：腺嘌呤核糖核苷一磷酸（腺苷一磷酸、腺苷酸）（adenosine monophosphate AMP）鸟嘌呤核糖核苷一磷酸（鸟苷一磷酸、鸟苷酸）（guanosine monophosphate GMP）胞嘧啶核糖核苷一磷酸（胞苷一磷酸、胞苷酸）（cytidine monophosphate CMP）尿嘧啶核糖核苷一磷酸（尿苷一磷酸、尿苷酸）（uridine monophosphate UMP）,AMP,GMP,UMP,CMP,DNA中的脱氧核苷酸有4种：腺嘌呤脱氧核糖核苷一磷酸（脱氧腺苷酸）（deoxyadenosine monophosphate dAMP）鸟嘌呤脱氧核糖核苷一磷酸（脱氧鸟苷酸）（deoxyguanosine monophosphate dGMP）胞嘧啶脱氧核糖核苷一磷酸（脱氧胞苷酸）（deoxycytidine monophosphate dCMP）胸腺嘧啶脱氧核糖核苷一磷酸（脱氧胸苷酸）（deoxythymidine monophosphate dTMP）,dAMP,dGMP,dTMP,dCMP,（五）重要的其他核苷酸衍生物,1.多磷酸核苷酸,各种核苷一磷酸（NMP）继续磷酸化可生成为核苷二磷酸（NDP）和核苷三磷酸（NTP）例如：AMP（adenosine monophosphate）ADP（adenosine diphosphate）ATP（adenosine triphosphate）,AMP,ADP,ATP,2.环化核苷酸,环腺苷酸,（cyclic AMP cAMP）,环鸟苷酸（cyclic GMP cGMP）,它们作为细胞之间传递信息的信使。,N,cAMP,cGMP,二、核酸的一级结构,指核苷酸残基沿多核苷酸链的排列次序。,实验证明，DNA和RNA是没有分支的多核苷酸链。,1.连接方式：,3,5,-,磷酸二酯键,2.确定：3,-末端和5,-末端,3.核酸的一级结构：各种不同的核苷酸在多核苷酸链上的排列顺序。,5-末端磷酸,3-末端羟基,3，5-磷酸二酯键,4.核酸一级结构的表达方式：,（1）化学结构式：繁琐、复杂。,（2）简写式,pApCpGpUpC,p表示为磷酸基团，p在碱基的左侧表示与戊糖的5-OH结合，右侧表示与戊糖的3-OH结合。,读向：左 右 碱基序列：5,3,T C A T G A,5P P P P P P OH 3,5pTpCpApTpGpA-OH 3,5TCATGA 3,（3）竖线式,三、DNA的二级结构双螺旋结构,（一）双螺旋结构的主要依据,1.,DNA碱基组成的Chargaff规则,组成的四种碱基：A、G、C、T,腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩尔数相等，A=T,鸟嘌呤和胞嘧啶的摩尔数相等，C=G,嘌呤碱基总数=嘧啶碱基总数,即：A+G=C+T,DNA的碱基组成有物种的特异性，不同物种的DNA有其独特的碱基组成。,同一物种不同组织、器官有相同DNA碱基,组成，不受生长发育、营养状况及环境影响。,DNA,来源,腺嘌呤（,A,）,胸腺嘧啶（,T,）,鸟嘌呤（,G,）,胞嘧啶（,C,）,（,A+T,）,/,（,G+C,）,大肠杆菌,25.4,24.8,24.1,25.7,1.01,小麦,27.3,27.1,22.8,22.7,1.21,鼠,28.6,28.4,21.4,21.5,1.33,猪：肝,29.4,29.7,20.5,20.5,1.43,胸腺,30.0,28.9,20.4,20.7,脾,29.6,29.2,20.4,20.8,酵母,31.3,32.9,18.7,17.5,1.079,不同生物来源的DNA四种碱基比例关系,2.X-光衍射数据,1938年，Astbury等用小牛胸腺DNA纤维做X-射线衍射分析，发现有0.34nm的周期变化。,以后Franklin和Wilkins对DNA的X-衍射进行了更多的研究，获得清晰的衍射图谱。说明DNA是由2条或2条以上的多核苷酸链组成，沿长轴有0.34nm和3.4nm两个重要的周期性变化。,DNA的Na盐纤维和DNA晶体的X光衍射图谱,Franklin,（3）DNA的滴定曲线,DNA分子中的磷酸基可被滴定，碱基的可解离基团不能被滴定。,1953年，J.Watson和F.Crick 在前人研究工作基础上，根据DNA结晶X-衍射图谱，提出了著名的DNA双螺旋结构模型（The double helical model of DNA structure），并对模型的生物学意义作出了科学的解释和预测，这是20世纪生物科学最伟大的成就。因此而获得了诺贝尔奖。,（二）双螺旋结构模型（B-DNA）要点,1.DNA分子由两条反向平行的多核苷 酸链（一条链5 3,另一条链3 5）沿同一中心轴右手盘绕而成。,磷酸与脱氧核糖通过 3,5-磷酸二酯键相连接，构成DNA分子的主链骨架。,两条主链是由磷酸-脱氧核糖交替而成，位于双螺旋外侧，侧链（碱基）位于双螺旋内侧。,碱基平面与纵轴垂直，糖环平面与纵轴平行.,2.两条链之间存在碱基互补的关系。即：,A和T配对，中间形成两个氢键；,C和G配对，中间形成三个氢键。,5,3,3.,螺旋直径2nm，相邻碱基平面垂直距离0.34nm,螺旋结构每隔10个碱基对（base pair,bp）重复一次，间隔为3.4nm。,4.,双螺旋的表面含有明显的大沟和小沟，其宽度分别为2.2nm和1.2nm,，其碱基对暴露在外，与其他调节分子相互作用。,5.双螺旋结构的稳定因素 （1）互补碱基之间氢键 主要决定碱基配对的特异性，而对双螺旋稳定的贡献不是最重要的。（2）碱基堆积力 包括疏水作用和范德华力。为螺旋稳定的主要作用力。,（3）溶液中的阳离子或带正电荷的化合物对DNA表面磷酸基团的中和，消除了静电斥力。,（三）DNA二级结构的构象类型,DNA在不同盐溶液及不同相对湿度下可以各种不同状态存在：,（1）B-DNA 相对湿度92%的钠盐，典型的Watson-Crick双螺旋DNA，右手双螺旋，每圈螺旋10.4个bp，螺距：3.32nm。,（2）A-DNA 相对湿度75%钠盐，右手双螺旋，外形粗短。RNA-RNA、RNA-DNA杂交分子具有这种结构。,（3）Z-DNA 1979年Rich等发现。,GC交替的寡聚体，左手螺旋，外形细长。天然B-DNA的局部区域可以形成Z-DNA。,A-DNA B-DNA Z-DNA,（四）DNA双螺旋结构模型的意义,该模型揭示了DNA作为遗传物质的稳定性特征，最有价值的是确认了碱基配对原则，这是是DNA复制、转录和反转录的分子基础，亦是遗传信息传递和表达的分子基础。该模型的提出是本世纪生命科学的重大突破之一，它奠定了生物化学和分子生物学乃至整个生命科学飞速发展的基石。,四、DNA的高级结构,DNA在双螺旋结构基础上通过扭曲和折叠所形成构象。超螺旋是三级结构主要形式。,（一）双链环状DNA分子（dcDNA）,存在于某些细菌的染色体、质粒、病毒、真核生物的线粒体和叶绿体中。,在共价闭环双螺旋基础上进一步扭转盘曲,形成超螺旋(supercoil)体积进一步压缩。,拓扑连环数（linking number）L：一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数。,扭转数（twisting number）T：B-DNA模型双螺旋数。,超螺旋数（writhing number）W,L=T+W,W=0 松弛环,W 0 正超螺旋（左手扭曲,）,（二）双链线性DNA（dsDNA）分子,存在于真核生物的染色质和一些病毒中。,五、DNA和基因组,本部分为自学内容。,六、RNA的结构和功能,组成RNA的戊糖是核糖，主要碱基：A、U、G、C，U替代DNA中的T，还常有一些稀有碱基。,RNA的结构单位主要是四种核苷酸：AMP、GMP、CMP、UMP。,核苷酸连接方式：3,5-磷酸二酯键。,天然RNA分子都是单链线形分子（有些病毒是双链），可自身回折，形成局部双螺旋（A-型，AU、GC），RNA中约40%-70%的核苷酸参与螺旋的形成。,稳定性较差，易水解。,（一）tRNA（transfer RNA）,1.tRNA概况：,（1）含量：占细胞内RNA总量的15%。,（2）种类：50-60种，真核可达100多种（同工tRNA：运载同一氨基酸的几种tRNA）。,（3）分子量：23-28kD，4S。,（4）功能：专一携带氨基酸，是氨基酸运载工具。有些tRNA可作为反转录酶的引物，参与DNA的合成。,2.tRNA一级结构,（1）组成：70-90个核苷酸（标准：76nt）。,（2）不变和半不变的核苷酸：约有20多种。半不变的核苷酸主要是嘌呤或嘧啶间的互换的核苷酸。,（3）TCG序列：54-57位，与 5S rRNA结合并与 tRNA 空间结构有关。,（4）修饰碱基（修饰核苷酸）：转录后加工而形成，2-19个，70多种，占10%。,3.tRNA,的二级结构,tRNA的二级结构都呈“三叶草”形状，一般可将其分为四臂四环：,四环,二氢尿嘧啶环：8-12nt,反密码环：7nt,TC环:7nt,额外环4-5nt 可变,四臂,氨基酸臂：7bp 3-CCA,二氢尿嘧啶臂：D臂 3bp,反密码臂：5bp,TC臂：5bp,酵母tRNA,Ala,的二级结构,DHU环,I,G,C,反密码子,反密码环,氨基酸臂,可变环,C,C,A,Ala,3,5,TC环,4.tRNA,的三级结构,倒“L”形，是所有tRNA折叠后形成大小相似及三维构象相似三级结构，这有利于携带的氨基酸的tRNA进入核糖体的特定部位。,（二）mRNA,（,messenger RNA）,概念：1961年Jacob和Monod提出用信使RNA命名。是带有从DNA上的到信息并指导蛋白质合成的一类RNA分子，称信使RNA。,含量：3-5%平均分子量50万，8S。,功能：蛋白质合成模板（遗传密码）。,hnRNA：真核生物RNA前体，需剪接、加工后为成熟的mRNA。,（三）rRNA（ribosomal RNA）,占RNA总量的80，与蛋白质结合组成核糖体，是生物体内蛋白质合成的场所。,种类：,细菌有16S、5S、23S三种，组成30S的转录单位。,真核生物有18S、5.8S、28S和5S四种，前3种组成45S的转录单位，5S rRNA单独转录。,rRNA的二级结构：茎环结构,大肠杆菌 5S rRNA 结构,七、核酸的理化性质,核酸的结构特点：分子大，有一些可解离的基团，具有共轭双键等。,（一）一般理化性质,1.两性电解质。含有磷酸基和碱基，但表现为酸性。,2.RNA纯品是白色的粉末，DNA为疏松的石棉一样的纤维状固体。,3.线性大分子，极不对称，具有粘度高，抗剪切力差等特点。,3.溶解性：RNA和DNA都是极性的化合物，一般都微溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂，但其钠盐易溶于水。,4.RNA的磷酸二酯键对碱敏感，室温下，被稀碱水解为2-或3-核苷酸。DNA在碱中虽变性，但不被水解，所以DNA更稳定。,5.鉴别DNA和RNA的反应：,RNA：D-核糖+浓盐酸+苔黑酚,绿色,DNA：D-2-脱氧核糖+酸+二苯胺,蓝紫色,（二）核酸的紫外吸收,1.核酸中的碱基有共轭双键体系，有独特的紫外线吸收光谱，其吸收峰240-290nm，最大吸收峰260nm。,2.天然核酸比其各核苷酸成分的光吸收值之和少30-40%（如图）。,1.天然DNA,2.变性DNA,3.核苷酸总吸收值,（三）核酸的变性、复性与分子杂交,1.核酸的变性,（1）变性（denaturation）的概念,某些理化因素使核酸分子互补双链之间的氢键断裂，使双螺旋变成松散单链的过程。,（2）变性因素,热变性：80几分钟，螺旋线团,酸碱变性（pH小于4或大于11）,变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）,（3）变性表征,黏度下降、比旋光度下降、沉降系数增加、浮力密度增大、酸碱滴定曲线改变、生物活性丧失。,增色效应（hyperchromic effect）：,变性后的核酸紫外吸收值增加的现象。,（4）热变性和Tm,DNA的热变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。,Tm：即解链温度或熔解温度（melting temperature），指核酸加热变性过程中，A,260,紫外吸收的增加量达最大量一半时的温度。,在T,m,时，DNA内50%的双链结构被解开。,DNA的Tm一般在82-95之间。,DNA的热变性曲线,影响T,m,值大小因素,核酸均一性：,均一性高，变性温度范围越窄,。,G-C,含量与,Tm,值成正比。经验公式：,T,m,=69.3+0.41(G+C)%,介质离子强度：离子强度低，,T,m,低；离子强度高，,T,m,高。,pH,：,影响碱基的解离。高,pH,下，碱基失去质子，影响碱基对之间氢键的形成，,T,m,下降。,变性剂：尿素、甲醛等破坏氢键，,Tm,下降。,2.核酸的复性,（1）复性（renaturation）的概念,又称退火（annealing），指变性DNA在一定条件下如温度逐步恢复到生理范围内，两条互补链重新恢复天然的双螺旋构象。,The denaturation and renaturation of double-stranded DNA,（2）减色效应（hypochromic effect）,复性使紫外吸收降低的现象。,（3）复性条件,温度 缓慢冷却可复性。快速冷却称淬火（quenching），不能复性。,DNA,浓度：浓度较高，复性较快。,DNA片段大小：片段越大，复性越慢。,（4）复性速度：复性速度可用 C,o,t 衡量，,C,o,为变性DNA原始浓度molL,-1,，,t 为时间，以秒表示。,不同DNA的复性动力学曲线,。,3.分子杂交,（1）分子杂交的概念,不同来源DNA单链间或单链DNA与RNA之间只要有碱基配对区域，复性时可形成局部双螺旋区，称核酸分子杂交（hybridization）,（2）,分子探针（probe）,带有某种标记物的已知序列的RNA或DNA片段。,制备特定的探针通过杂交技术可进行基因的检测和定位研究。,（3）分子杂交实例,Southern Blotting 可用于DNA之间同源性分析，确定特异性DNA序列的大小和定位。,基本步骤是：,DNA样品 酶切 电泳 碱变性 转膜 固定 杂交 洗涤 放射自显影,Northern Blotting,研究对象是mRNA，探针一般是DNA。,Western Blotting,抗原与抗体的杂交，研究克隆基因表达产物，鉴定克隆株的常用技术。,八、核酸的序列测定,双脱氧终止法,英国Sanger于1955年确定牛胰岛素一级结构，1958年获诺贝尔化学奖。1975年设计出DNA测序法，1980年获诺贝尔化学奖。,