医疗器械微生物检验PPT课件.ppt
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1、医疗器械微生物限度检验1.概述n n微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。微生物限度检查细菌、真菌菌落数控制菌2.概述n n微生物:形体微小,结构简单,通常要用光学显微生物:形体微小,结构简单,通常要用光学显微镜和电子显微镜才能看清楚的生物微镜和电子显微镜才能看清楚的生物n n特点:特点:1 1、个体微小,一般、个体微小,一般0.1mm0.1mm 2 2、构造简单,有单细胞的,简单多细胞、构造简单,有单细胞的,简单多细胞 的,非细胞的的,非细胞的 3 3、进化地位低、进化地位低n n分类:原核类:二菌,四体(分类:原核类:二菌,四体(细菌、放线菌、螺旋体、细
2、菌、放线菌、螺旋体、支原体、立克次氏体、衣原体支原体、立克次氏体、衣原体)真核类:真菌,原生动物,显微藻类真核类:真菌,原生动物,显微藻类 非细胞类:病毒,亚病毒非细胞类:病毒,亚病毒3.4.概述n n医疗用品的分类医疗用品的分类n n按医疗用品与人体接触的性质以及对人体使用安全按医疗用品与人体接触的性质以及对人体使用安全性要求分三类:性要求分三类:a)a)类医疗用品:接触人体完整皮肤的医疗用品类医疗用品:接触人体完整皮肤的医疗用品 b)b)类医疗用品:接触人体未破损粘膜的医疗用品类医疗用品:接触人体未破损粘膜的医疗用品 c)c)类医疗用品:进入人体无菌组织、器官和血液类医疗用品:进入人体无菌
3、组织、器官和血液 以及接触破损皮肤和粘膜的医疗以及接触破损皮肤和粘膜的医疗 用品用品 5.常用检测标准n n中华人民共和国药典中华人民共和国药典 2010 2010年版二部附录年版二部附录XI J“XI J“微生物限度检查法微生物限度检查法”n nGB 15979-2002 GB 15979-2002 一次性卫生用品卫生标准附一次性卫生用品卫生标准附录录B Bn nISO11737-1:2006 Sterilization of medical ISO11737-1:2006 Sterilization of medical devices Microbiological methodsPar
4、t1:devices Microbiological methodsPart1:Determination of a population of microorganisms Determination of a population of microorganisms on productson products6.项目项目药典药典20102010GB15979-2002GB15979-2002细菌细菌定量:营养琼脂培养基定量:营养琼脂培养基 2 2个平皿个平皿定量:营养琼脂培养基定量:营养琼脂培养基 5 5个平皿个平皿真菌真菌定量:玫瑰红钠琼脂培养基定量:玫瑰红钠琼脂培养基 至少至少2 2
5、个平皿个平皿 72h 72h 酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基定量:沙氏琼脂培养基定量:沙氏琼脂培养基 5 5个平皿个平皿 7 7天天定性:沙氏液体培养基定性:沙氏液体培养基 7 7天天大肠大肠埃希菌埃希菌 胆盐乳糖培养基胆盐乳糖培养基 、MUGMUG培养基培养基 曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基 /大肠大肠菌群菌群胆盐乳糖发酵培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康胆盐乳糖发酵培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基凯琼脂培养基 、乳糖发酵培养基、乳糖发酵培养基乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂、乳糖发酵培乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝
6、琼脂、乳糖发酵培养基养基沙门菌沙门菌 营养肉汤营养肉汤 、四硫酸钠亮绿培养基、四硫酸钠亮绿培养基 、胆盐硫乳琼脂(或、胆盐硫乳琼脂(或沙门、志贺菌属琼脂)培养基和麦康凯琼脂(或曙红沙门、志贺菌属琼脂)培养基和麦康凯琼脂(或曙红亚蓝琼脂)培养基亚蓝琼脂)培养基 、三糖铁琼脂培养基、三糖铁琼脂培养基 /铜绿假单铜绿假单胞菌胞菌胆盐乳糖胆盐乳糖 、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基 、氧化酶、氧化酶试验试验 、绿脓菌素试验、绿脓菌素试验、SCDLPSCDLP培养基、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养培养基、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基基 、氧化酶试验、氧化酶试验 、绿脓菌素试验、硝酸
7、盐还原、绿脓菌素试验、硝酸盐还原产气试验、明胶液化试验产气试验、明胶液化试验4242生长试验生长试验金黄色金黄色葡萄球菌葡萄球菌 亚碲酸钠(钾)肉汤(或营养肉汤)培养基亚碲酸钠(钾)肉汤(或营养肉汤)培养基 、卵黄氯、卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基 、血浆凝、血浆凝固酶试验固酶试验 SCDLPSCDLP培养基、血琼脂培养基、甘露醇发酵试培养基、血琼脂培养基、甘露醇发酵试验、血浆凝固酶试验验、血浆凝固酶试验梭菌梭菌 庖肉培养基、含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基庖肉培养基、含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基 、过、过氧化氢酶试验氧化氢酶试验 /溶血性链
8、溶血性链球菌球菌/葡萄糖肉汤、血琼脂培养基、链球菌试验、杆葡萄糖肉汤、血琼脂培养基、链球菌试验、杆菌肽敏感试验菌肽敏感试验 白色念珠白色念珠菌菌沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、念沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、念珠菌显色培养基、珠菌显色培养基、1%1%聚山黎脂聚山黎脂80-80-玉米琼脂培养基、玉米琼脂培养基、芽管试验芽管试验/7.实验条件n n无菌操作技术n n实验环境n n实验器材8.无菌操作技术n n微生物学基础n n微生物实践基础n n无菌操作意识9.实验环境n n洁净度洁净度1000010000级下的局部洁净度级下的局部洁净度100100级的单向流空级的单向流
9、空气区域或隔离系统;气区域或隔离系统;n n定期按定期按GB/T16292-16294GB/T16292-16294:20102010医药工业洁净医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度验证;的现行国家标准进行洁净度验证;n n实验中监控:实验时将制备好的营养琼脂平板打实验中监控:实验时将制备好的营养琼脂平板打开放于实验台上,至实验结束收起,开放于实验台上,至实验结束收起,30 30 35 35培养培养48h48h,菌落平均数应小于,菌落平均数应小于1cfu1cfu/90mm。10.实验器具n n仪器仪器 超净工作
10、台、光学显微镜、恒温培养箱、压力蒸超净工作台、光学显微镜、恒温培养箱、压力蒸汽灭菌器、薄膜过滤装置、比浊仪等。汽灭菌器、薄膜过滤装置、比浊仪等。n n用具用具 试管、注射器、三角瓶、刻度吸管、移液器、精试管、注射器、三角瓶、刻度吸管、移液器、精密密PHPH试纸、滤膜、滤杯、剪刀、镊子、无菌服、试纸、滤膜、滤杯、剪刀、镊子、无菌服、牛皮纸等。牛皮纸等。11.实验准备n n实验环境保证n n实验试液n n培养基n n灭菌方法12.实验环境保证n n环境清洁,表面消毒(75%(V/V)乙醇、新洁尔灭(1:1000)溶液或其他适宜消毒溶液)n n空气过滤系统,紫外灯或臭氧空气消毒仪13.实验试液n n
11、稀释剂稀释剂 1.0.9%1.0.9%氯化钠溶液氯化钠溶液 2.pH6.8 2.pH6.8无菌磷酸盐缓冲液、无菌磷酸盐缓冲液、pH7.6pH7.6无菌磷酸盐缓冲液无菌磷酸盐缓冲液 3.pH7.0 3.pH7.0氯化钠氯化钠-蛋白胨缓冲液:调解蛋白胨缓冲液:调解pHpH至近中性,其中蛋至近中性,其中蛋白胨对细菌细胞有保护作用有利于菌落数及控制菌测定。白胨对细菌细胞有保护作用有利于菌落数及控制菌测定。n n表面活性剂、中和剂或灭活剂表面活性剂、中和剂或灭活剂n n鉴定用试剂鉴定用试剂 1.1.靛基质试液靛基质试液 2.2.1%1%二盐酸二甲基对苯二胺试液(氧化酶试液)二盐酸二甲基对苯二胺试液(氧化
12、酶试液)3.3.三氯甲烷三氯甲烷 4.1mol/l 4.1mol/l盐酸试液盐酸试液 14.培养基n n标准菌株处理及增菌用培养基n n选择性培养基n n鉴别培养基15.培养基n n培养基的酸碱度应符合细菌生长要求。应按各种培养基要求准确测定调节pH值。多数细菌生长的适宜pH值为7.27.6。酵母菌霉菌(6.06.5)。调节可用1N HCl或NaOH。n n培养基的灭菌时间和温度,应按照各种培养基的规定进行,以保证灭菌效果及不损失培养基的必需营养成分。n n制成的培养基应透明,以便观察细菌生长性状以及其他代谢活动所产生的变化。16.灭菌方式n n湿热:115 121,15min30min 物品
13、切勿立即取出置冷处,以免急速冷却,使灭菌物品内蒸气冷凝造成负压,以致染菌。n n干热:160 170 ,2h 适于耐高温的玻璃、陶瓷或金属器皿的灭菌。n n灭菌程序需要经过验证。17.计数培养基适用性检查n n细菌、霉菌及酵母菌计数用培养基应进行培养基的适用性检查,成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应检查。18.计数培养基适用性检查n n菌种菌种 大肠埃希菌大肠埃希菌 CMCCCMCC(B B)44 10244 102 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 CMCCCMCC(B B)26 003 26 003 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌 CMCCCMCC(B B)63 501 63 501
14、白色念珠菌白色念珠菌 CMCC(F)CMCC(F)98 001 98 001 黑曲霉黑曲霉 CMCC(F)98 003 CMCC(F)98 003n n验证试验所用的菌株传代次数不得超过验证试验所用的菌株传代次数不得超过5 5代(从菌代(从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0 0代),并采代),并采用适宜的菌种保藏技术,以保证试验菌株的生物用适宜的菌种保藏技术,以保证试验菌株的生物学特性。学特性。19.计数培养基适用性检查n n菌液制备菌液制备 取细菌新鲜培养物(一般取细菌新鲜培养物(一般18h24h18h24h,白念,白念24h48h 24h48h,黑曲霉,黑
15、曲霉 57 57天天 ),用),用0.9%0.9%无菌氯化无菌氯化钠溶液制成每钠溶液制成每1ml 1ml 含菌数含菌数50cfu100cfu50cfu100cfu的菌悬液的菌悬液 (黑曲霉用含(黑曲霉用含0.05%0.05%聚山梨酯聚山梨酯8080的的0.9%0.9%无菌氯化无菌氯化钠溶液);钠溶液);n n菌悬液在室温下放置应在菌悬液在室温下放置应在2 2小时内使用,若保存在小时内使用,若保存在2 2 8 8可以在可以在2424小时内使用。黑曲霉孢子悬液小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在可保存在2 2 8 8,在验证过的贮存期内使用。,在验证过的贮存期内使用。20.计数培养基适用性检查n n
16、培养基接种培养基接种 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌2 2个平皿个平皿营养琼脂培养基营养琼脂培养基 大肠埃希菌大肠埃希菌2 2个平皿个平皿 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌2 2个平皿个平皿 玫瑰红钠琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基 白色念珠菌白色念珠菌2 2个平皿个平皿 黑典霉黑典霉2 2个平皿个平皿酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基:白色念珠菌酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基:白色念珠菌2 2个平皿个平皿用相同的对照培养基替代被检培养基做对照用相同的对照培养基替代被检培养基做对照21.计数培养基适用性检查n n结果判定 若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%,且菌落形态大小应与对照培养基
17、上的菌落一致,判该培养基的适用性检查符合规定。22.样品准备n n供试品进入无菌实验室前应作表面消毒,用适宜的消毒液对供试品容器表面进行彻底消毒。n n检验数量:应从2个以上最小包装单位中抽取供试品,膜剂还不得少于4片。n n一般应随机抽取不少于检验用量(两个以上最小包装单位)的3倍量供试品。23.样品准备n n检验量:除另有规定外,一般供试品的检验量为10 g或10ml;化学膜剂100cm2;贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品,其检验应增加20g或20ml(其中10g或10ml用于阳性对照试验)。24.供试液制备n n液体供试品、固体、半固体或黏稠液供试品液体供试
18、品、固体、半固体或黏稠液供试品 取取10ml10ml或或10g10g用用pH7.0pH7.0无菌氯化钠无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至蛋白胨缓冲液稀释至100ml100ml,混匀,作为混匀,作为1 1:1010的供试液。油剂可加入适量的无菌吐温的供试液。油剂可加入适量的无菌吐温8080使供使供试品分散均匀试品分散均匀;水溶性液体亦可用混合供试品原液作为供试液;水溶性液体亦可用混合供试品原液作为供试液;n n非水溶性供试品非水溶性供试品 :乳化或萃取:乳化或萃取;n n膜剂供试品膜剂供试品 :取供试品:取供试品100cm100cm2 2,剪碎,加,剪碎,加pH7.0pH7.0无菌氯化钠无菌氯化钠-
19、蛋蛋白胨缓冲液白胨缓冲液100ml100ml浸泡,振摇,作为浸泡,振摇,作为1 1:1010的供试液的供试液;n n肠溶及结肠溶制剂供试品:取供试品肠溶及结肠溶制剂供试品:取供试品10g 10g ,加,加pH6.8pH6.8无菌磷酸盐无菌磷酸盐缓冲液缓冲液(用于肠溶制剂用于肠溶制剂)PH7.6)PH7.6无菌磷酸盐缓冲液(用于结肠溶制无菌磷酸盐缓冲液(用于结肠溶制剂)至剂)至100ml100ml,置,置4545水浴中,振摇,使溶解,作为水浴中,振摇,使溶解,作为1 1:1010的供的供试液试液;n n气雾剂、喷雾剂供试品气雾剂、喷雾剂供试品 ,经处理后同第一项制备供试液,经处理后同第一项制备供
20、试液;n n贴剂供试品贴剂供试品n n具抑菌活性的供试品具抑菌活性的供试品 :培养基稀释法:培养基稀释法 、离心沉淀法、离心沉淀法 、薄膜过滤、薄膜过滤法法 、中和法、中和法;25.细菌、霉菌及酵母菌计数 n n实验方法倾注平皿法薄膜过滤法n n培养基细菌总数:营养琼脂培养基 霉菌及酵母菌计数:玫瑰红钠琼脂培养基、酵母浸出粉胨葡萄琼脂培养基 26.细菌、霉菌及酵母菌计数n n培养和计数培养和计数除另有规定外,细菌培养除另有规定外,细菌培养3 3天,逐日点计菌落数天,逐日点计菌落数霉菌、酵母菌培养霉菌、酵母菌培养5 5天,逐日点计菌落数天,逐日点计菌落数必要时可延长至必要时可延长至7 7天进行菌
21、落计数天进行菌落计数点计菌落数后,计算各稀释级供试液的平均菌落点计菌落数后,计算各稀释级供试液的平均菌落数,按菌数报告规则报告菌数数,按菌数报告规则报告菌数27.细菌、霉菌及酵母菌计数n n方法验证方法验证n n(1 1)试验组)试验组 平皿法:供试液平皿法:供试液1ml+1ml 1ml+1ml 试验菌菌悬液,平行制试验菌菌悬液,平行制备备2 2个平皿,菌落计数;个平皿,菌落计数;薄膜过滤法:供试液,过滤,冲洗,在最后一次薄膜过滤法:供试液,过滤,冲洗,在最后一次的冲洗液中加入的冲洗液中加入1ml1ml试验菌,过滤,菌落计数;试验菌,过滤,菌落计数;n n(2 2)菌液组)菌液组 测定所加的试
22、验菌数;测定所加的试验菌数;n n(3 3)供试品对照组)供试品对照组 取规定量供试液,按菌落计取规定量供试液,按菌落计数方法测定供试品本底菌数;数方法测定供试品本底菌数;n n(4 4)稀释剂对照组)稀释剂对照组 若供试液制备需要分散、乳若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时,应增化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时,应增加稀释剂对照组,以考察供试液制备过程中微生加稀释剂对照组,以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。稀释剂物受影响的程度。稀释剂+试验菌菌悬液;试验菌菌悬液;28.细菌、霉菌及酵母菌计数n n验证试验至少应进行验证试验至少应进行3 3次独立的平行试验,
23、并分别次独立的平行试验,并分别计算各试验菌每次试验的回收率。计算各试验菌每次试验的回收率。n n结果判断结果判断 在在3 3次独立的平行试验中,稀释剂对照组的菌数回次独立的平行试验中,稀释剂对照组的菌数回收率应均不低于收率应均不低于70%70%;若试验组的菌数回收率均不低于若试验组的菌数回收率均不低于70%70%,可照该供,可照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数;及酵母菌数;若任一次试验中试验组的菌数回收率低于若任一次试验中试验组的菌数回收率低于70%70%,应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、应采用培养基稀释法、离心沉淀
24、法、薄膜过滤法、中和中和 法等方法或联合使用这些方法消除供试品的法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性,并重新进行方法验证。抑菌活性,并重新进行方法验证。29.细菌、霉菌及酵母菌计数n n1.1.平皿法平皿法采用平皿法进行菌数测定时,应取适宜的连续采用平皿法进行菌数测定时,应取适宜的连续2323个稀释级的供试液。个稀释级的供试液。取供试液取供试液1ml1ml,置直径,置直径90mm90mm的无菌平皿中,注入的无菌平皿中,注入1520ml 1520ml 温度不超过温度不超过4545的溶化的营养琼脂培养的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄琼基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵
25、母浸出粉胨葡萄琼脂培养基,混匀,凝固,倒置培养。每稀释级每脂培养基,混匀,凝固,倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备种培养基至少制备2 2个平板。个平板。阴性对照试验阴性对照试验 取试验用的稀释液取试验用的稀释液1ml1ml,置无菌平,置无菌平皿中,注入培养基,凝固,倒置培养。每种计数皿中,注入培养基,凝固,倒置培养。每种计数的培养基各制备的培养基各制备2 2个平板,均不得有菌生长。个平板,均不得有菌生长。30.细菌、霉菌及酵母菌计数营养琼脂营养琼脂-细菌细菌 玫瑰红钠琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基-霉菌霉菌31.细菌、霉菌及酵母菌计数n n1.1.平皿法平皿法n n菌数报告规则:菌数报告规则:
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