MALDI-TOF-MS在细菌检测中的应用.ppt
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1、MALDI-TOF-MS在细菌检测中的应用在细菌检测中的应用2一现有的细菌检测方法及其缺陷二基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱三MALDI-TOF-MS在临床微生物中的应用一、一、现有的细菌检测方现有的细菌检测方法及其缺陷法及其缺陷3现有的细菌检测方法及其缺陷现有的细菌检测方法及其缺陷经典方法初步分类:菌落形态、显微镜检查、以及趋向性试验,如革兰染色、氧化酶和触酶。鉴定属或种:以细菌生长代谢过程为基础的特征性的生理生化反应、选择培养基生长情况。缺陷虽然某些生化试验只需要数分钟即可完成,但对于绝大多数经过转种、培养的微生物标本,通常要得到一个完整的鉴鉴定定报报告告大大约约要要24-48h24-48
2、h,某些苛氧菌或生长慢的细菌则耗时更多。操作繁琐、主观性强。4现有的细菌检测方法及其缺陷现有的细菌检测方法及其缺陷分子生物学方法1.1.细菌核糖体(细菌核糖体(16S rRNA16S rRNA)基因序列分析:)基因序列分析:rRNA寡核苷酸序列是细胞中最稳定的序列,比DNA稳定的多。细菌中有三种rRNA,23S、16S和5S,其中16S rRNA因其核苷酸数目适中、信息量大、具有高度稳定性、易于提取和分析而成为理想的细菌鉴定的研究对象。通过分析比较细菌rRNA序列的相关性确定细菌种系的发生关系。5现有的细菌检测方法及其缺陷现有的细菌检测方法及其缺陷分子生物学方法 2.2.其他:其他:鸟嘌呤加胞
3、嘧啶碱基比例的测定(G+C mol%),核酸的分子杂交 实时荧光定量PCR缺陷:技术复杂、耗费高、假阳性率高、不能自动化、高通量。不适合临床常规检测!不适合临床常规检测!6迫切需要找到一种新的病原微生物快速诊断的方法,以满足临床需要7现有的细菌检测方法及其缺陷现有的细菌检测方法及其缺陷二、基质辅助激光解吸电离二、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱飞行时间质谱8(一)质谱的基本概念(一)质谱的基本概念9质谱的基本概念质谱的基本概念质谱法(Mass Spectrometry,MS):定义:用电场和磁场将运动的离子(带电荷的原子、分子或分子碎片,)按它们的质荷比分离后进行检测的方法。没有两个核素的质量
4、是一样的,也没有一种核素的质量恰好是另一种核素质量的整数倍。分析这些离子可获得化合物的分子量、化学结构、裂解规律等信息。10原理:使样品中各组分电离生成不同质荷比的离子,经加速电场的作用,形成离子束,进入质量分析器。利用电场和磁场使其发生相反的速度色散,离子束中:速度慢的离子通过电场后偏转大,速度快的偏转小速度慢的离子在磁场中偏转较大,速度快的偏转小在磁场中还能发生质量的分离,使不不同同质质荷荷比比的的离离子子聚聚焦焦在在不不同同的的点点上上,将它们分别聚焦而得到质谱图,从而确定其质量。11质谱的基本概念质谱的基本概念仪器:利用运动离子在电场和磁场中偏转原理设计的仪器称为质谱计或质谱仪。质谱计
5、指用电子学方法检测离子,而质质谱谱仪仪指离子被聚焦在照相底板上进行检测。质谱法的仪器种类较多。有单聚焦质谱计、双聚焦质谱计和四极矩质谱计等。后两种用得较多,而且多与气相色谱仪和电子计算机联用。12质谱的基本概念质谱的基本概念高真空系统:质谱计必须在高真空下才能工作。高真空的阀泵系统一般由前级泵(常用机械泵)和油扩散泵或分子涡轮泵等组成。扩散泵能使离离子子源源保持在10-6 10-7毫米汞柱的真空度。在分分析析器器中还有一只扩散泵,能维持10-7 10-8毫米汞柱的真空度。13质谱的基本概念质谱的基本概念样品注入系统:可分直接注入、气相色谱、液相色谱、气体扩散四种方法。固固体体样样品品通通过过直
6、直接接进进样样杆杆将将样样品品注注入入,加加热热使使固固体体样样品转为气体分子。品转为气体分子。对不纯的样品可经气相或液相色谱预先分离后,通过接口引入。液相色谱/质谱接口有传动带接口、直接液体接口和热喷雾接口。14质谱的基本概念质谱的基本概念离子源:使样品电离产生带电粒子(离子)束的装置。应用最广的电离方法是电子轰击法(EI)。还有化学电离(CI)、光致电离、场致电离、激光电离、火花电离、表面电离、X 射线电离、场场解解吸吸电电离离(desorption ionization)和快原子轰击电离等。其中场解吸和快原子轰击特别适合测定挥发性小和对热不稳定的化合物。15质谱的基本概念质谱的基本概念质
7、量分析器:将离子源中形成的离子束按质荷比的大小进行分离的装置。它的结构有单聚焦、双聚焦、四极矩、飞行时间(Time of Flight,TOF)和摆线等。16质谱的基本概念质谱的基本概念收集器:经过分析器分离的同质量离子可用照相底板、法拉第筒或电子倍增器收集检测。质谱仪的分辨率和灵敏度等性能非常高,只需要ug甚至ng级的样品,就能得到一张满意的质谱图。对于微量不纯的化合物,可以利用气相色谱或液相色谱(对极性大的化合物)将化合物分离成单一组分,导入质谱计,录下质谱图。17质谱的基本概念质谱的基本概念应用:由于色谱仪质谱计联用后给出的信息量大,该法与计算机联用,使质谱图的规格化、背景或柱流失峰的舍
8、弃、元素组成的给出、数据的储存和计算、多次扫描数据的累加、未知化合物质谱图的库检索,以及打印数据和出图等工作均可由计算机执行,大大简化了操作手续。质谱法特别是它与色谱仪及计算机联用的方法,已广泛应用在有机化学、生化、药物代谢、临床、毒物学、农药测定、环境保护、石油化学、地球化学、食品化学、植物化学、宇宙化学和国防化学等领域。18质谱的基本概念质谱的基本概念色谱质谱计算机纯化纯化离子分离离子分离分析分析质谱仪:质谱仪种类繁多,不同仪器应用特点也不同。在300左右能汽化的样品,可以优先考虑用GC-MS进行分析,因为GC-MS使用电子轰击法电离源(EI源),得到的质谱信息多,可以进行库检索。在300
9、 左右不能汽化,需要用LC-MS分析,此时主要得到分子量信息,如果是串联质谱,还可以得一些结构信息。如果是生生物物大大分分子子,主要利用LC-MS和MALDI-TOF分析,主要获得分子量信息。对于蛋白质样品,还可以测定氨基酸序列。19质谱的基本概念质谱的基本概念质谱仪:质谱仪的分辨率是一项重要技术指标,高分辨质谱仪可以提供化合物组成式,这对于结构测定是非常重要的。双聚焦质谱仪,傅立叶变换质谱仪,带反射器的飞飞行行时间质谱仪时间质谱仪等都具有高分辨功能。20质谱的基本概念质谱的基本概念21质谱的基本概念质谱仪(二)基质辅助激光解吸电(二)基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱离飞行时间质谱221.什么
10、是MALDI-TOF-MS基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry)最近发展起来的一种质谱技术,能够提供各具特征的微生物蛋白质质量指纹图谱,通过检索特征性质质谱峰数据库或与已知微生物的质谱峰比较,来实现对微生物的快速鉴定具有快速、高灵敏度、高分辨率等优点,能够对核酸、蛋白质和多肽等生物大分子进行微量分析.23基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱2.主要概念MALDI(Matrix-Assisted Laser Desorp
11、tion Ionization)l是一种直接气化并离子化非挥发性生物样品的质谱离子化方式。l将被分析物的溶液和某种基质溶液混合,蒸发溶剂,使被分析物与基质成为晶体或半晶体,l再用一定波长的脉冲式激光进行照射,基质吸收激光能量后,均匀地传递给待分析物,使待分析物瞬间气化并离子化。l使用基质的主要目的是保护待分析物不会因为过强的激光能量导致化合物被破坏。24基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱2.主要概念TOF(Time Of Flight),飞行时间分析器:l具有相同动能,不同质量的离子,因其飞行速度不同而分离。l如果固定离子飞行距离,则不同质量离子的飞行时间不同,质
12、量小的离子飞行时间短而首先到达检测器。25基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱3.基本原理:l将微生物与等量的基质分别点在加样板上,溶剂挥发后形成样品和基质的共晶体l基质从激光中吸收能量使样品解吸,基质与样品之间发生电荷转移使得样品分子电离l经过飞行时间检测器,根据到达检测器的飞行时间不同而被检测。即通过测定离子的质荷比(M/Z)与离子的飞行时间成正比来检测离子的分子量l通过专用软件分析比较,确定出特异性的指纹图谱26基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱27MALDI-TOF-MS MALDI-TOF-MS 原理图原理图基质辅助激光解吸电
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