免疫组化技术简介PPT培训课件.ppt
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1、免疫免疫组组化技化技术术简简介介CONTENTS目录01基本概念02基本原理03操作流程04技术要点05结果判读06失败原因07质量控制CONTENTS目录01基本概念02基本原理03操作流程04技术要点05结果判读06失败原因07质量控制基本概念基本概念 应用免疫学基本原理抗原抗体反应,即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究,称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry,IHC)或 免 疫 细 胞 化 学 技 术(immunocytochemistr
2、y,ICC)。免疫免疫组化化基本概念基本概念抗原(抗原(Antigen,Ag)一类能刺激机体的免疫系统发生免疫应答,即产生抗体或致敏淋巴细胞等,并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外特异性结合的物质。抗体(抗体(Antibody,Ab)机体受抗原刺激后由B淋巴细胞,特别是浆细胞分泌产生的一种能与相应抗原发生反应的球蛋白,称为免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)。基本概念基本概念抗体的结构抗体的结构V区氨基酸的种类和排列顺序千变万化,故可形成许多种具有不同结合抗原特异性的抗体。(抗原特异性,第一抗体)C区氨基酸的组成和排列在同一种属动物Ig同型L链和同一类H链中都比较恒定。制备第二
3、抗体的重要基础。一抗:鼠抗人一抗:鼠抗人二抗:羊抗鼠二抗:羊抗鼠基本概念基本概念单克隆抗体单克隆抗体由同一克隆细胞产生,针对抗原分子上某一单个抗原决定簇的特异性抗体。多克隆抗体多克隆抗体由不同细胞产生,其免疫化学特性不同,能够识别抗原表面多种抗原决定簇的多种抗体的混合物。基因工程抗体基因工程抗体在基因水平上对Ig分子进行切割、拼接或修饰,甚至是在人工全合成后导入受体细胞表达产生的新型抗体。CONTENTS目录01基本概念02基本原理03操作流程04技术要点05结果判读06失败原因07质量控制基本原理基本原理抗原抗原显色色抗体抗体间接法接法直接法直接法PAP法法LSAB法法基本原理基本原理显色系
4、统显色系统酶免疫组化染色中的常用的酶及显色酶免疫组化染色中的常用的酶及显色底物底物辣根过氧化物酶/HRP:DAB、AEC碱性磷酸酶/AP:AP-Red、NBT/BCIP酶酶的的选择选择HRP染色结果比AP染色结果保存时间长含有内源性HRP的组织切片:首选标记酶为APAP和HRP结合可进行双重或3重免疫组化标记,对比清晰CONTENTS目录01基本概念02基本原理03操作流程04技术要点05结果判读06失败原因07质量控制操作流程操作流程CONTENTS目录01基本概念02基本原理03操作流程04技术要点05结果判读06失败原因07质量控制技术要点技术要点免疫原理的选择免疫原理的选择一抗一抗(属
5、种、单/多抗、浓缩/即用型)二二抗抗(属种、标记方法)显显色方式色方式技术要点技术要点取材取材组组织织切切片片:冷冻切片、石蜡切片(最常用);大小(110.5cm);取病变组织与正常组织交界处;避免对组织标本的损伤和挤压。印印片片:肝、脾、淋巴结等器官或组织(经新鲜标本最大面积剖开,充分暴露病灶,将载玻片轻轻压与组织切面,细胞粘附于玻片上,然后固定)(缺点是细胞分布不均匀,细胞有重叠)各各种种体体液液、穿穿刺刺液液:可直接涂片(血液、组织液等)或离心后涂片(细胞少脑脊液、腹水等)。培养细胞:培养细胞:悬浮细胞离心后涂片;贴壁细胞可爬片。取材取材时间要早(要早(24小小时以内),避免以内),避免
6、组织自溶,使抗原自溶,使抗原变性消失或性消失或严重弥散。重弥散。组织切切块厚度不易超厚度不易超过0.5cm,以便固定液的及,以便固定液的及时渗透及渗透及脱水。脱水。技术要点技术要点固定固定目目的的:凝固蛋白,终止细胞内酶的作用,防止细胞自溶;固定细胞形态和结构;保持组织细胞的抗原性;防止细胞层脱落;去除细胞内的脂类(妨碍抗体结合);防腐。注注意意事事项项:组织块不宜过大;固定液的量一般以组织块大小的30倍为宜;必须选择对组织渗透力强,同时又不致使组织过度收缩或膨胀的试剂;固定时间一般以24小时为宜。固固定定液液的的选选择择:所有的标本固定必须根据其性质及所进行的组织化学反应选择适当的固定剂。如
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