DB15∕T 2071-2021 动物垫料中 β-溶血性链球菌检测.pdf
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1、 ICS 07.100.99 CCS B 41 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 20712021 动物垫料中 -溶血性链球菌检测 Detection of -Streptococcus hemolyticus in animal bedding 2021-01-25 发布 2021-02-25 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 20712021 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。 中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国呼和浩特海关。 本文件主要起草人:王海艳
2、、赵治国、郝广福、盛万里、靳木子、马彩霞、敖威华、崔强、陈林军、延涵、陈宇飞。 DB15/T 20712021 1 动物垫料中-溶血性链球菌检测 1 范围 本文件规定了动物垫料中-溶血性链球菌的分离鉴定定性检测法。 本文件适用于动物垫料中-溶血性链球菌定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中, 注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 33682 基质辅助激
3、光解析电离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则 SN/T 1538.1 培养基制备指南 第1部分:实验室培养基制备质量保证通则 SN/T 1538.2 培养基制备指南 第2部分:培养基性能测试实用指南 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 动物垫料 animal bedding 用于吸收动物排泄物,使动物保持舒适生活环境的铺垫物。 注: 包括动物笼内非直接与动物机体接触的铺垫物。 4 设备和材料 4.1 冰箱:2 5 。 4.2 恒温培养箱:36 1 。 4.3 均质器。 4.4 漩涡振荡器。 4.5 电子天平:感量 0.1 g。 4.6 全自动微生物生化鉴定系统。 4.7 飞行时间
4、质谱仪。 4.8 二级生物安全柜。 4.9 厌氧培养装置。 4.10 光学显微镜。 4.11 水浴装置:36 1 。 DB15/T 20712021 2 4.12 pH 计。 4.13 无菌锥形瓶:容量 500 mL,250 mL。 4.14 无菌吸管:1 mL(具 0.01 mL 刻度) 、10 mL(具 0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸头。 4.15 无菌培养皿:15 mm90 mm。 4.16 无菌试管:18 mm180 mm。 4.17 无菌棉签。 4.18 无菌镊子。 4.19 无菌剪刀。 4.20 无菌勺。 4.21 无菌玻片。 4.22 无菌接种环。 4.23 无菌规格板(5
5、 cm5 cm) 。 5 培养基和试剂 -溶血性链球菌常用培养基与试剂灭菌后保存期限参见附录B。 5.1 实验用水:符合 GB/T 6682 的要求。 5.2 改良胰蛋白胨大豆肉汤(Modified tryptone soybean broth, mTSB) :见附录 A 中 A.2。 5.3 哥伦比亚 CNA 血琼脂(Columbia CNA blood agar):见附录 A 中 A.3。 5.4 哥伦比亚血琼脂(Columbia blood agar):见附录 A 中 A.4。 5.5 革兰氏染色液:见附录 A 中 A.5。 5.6 胰蛋白胨大豆肉汤(Tryptone soybean b
6、roth, TSB) :见附录 A 中 A.6。 5.7 0.25 氯化钙(CaCl2)溶液:见附录 A 中 A.7。 5.8 3 过氧化氢(H 2O 2)溶液:见附录 A 中 A.8。 5.9 无菌生理盐水:见附录 A 中 A.9。 5.10 生化鉴定试剂盒或生化鉴定卡。 5.11 飞行时间质谱仪靶板。 5.12 -溶血性链球菌标准菌株 ATCC10389,或等效菌株。 6 检验程序 -溶血性链球菌检验程序见图1。 DB15/T 20712021 3 图1 -溶血性链球菌检验程序 7 操作步骤 7.1 取样 7.1.1 取样原则 应遵循随机性、代表性的原则。取样过程遵循无菌操作程序,防止一切
7、可能的外来污染。 7.1.2 样品处理 7.1.2.1 颗粒状或粉末样品 对送检样品包装内不同部位样品进行随机多点取样至少250 g,充分混匀后称取25 g颗粒状或粉末状垫料样品,加入225 mL mTSB,充分振摇或均质1 min2 min,置36 1 培养18 h24 h,进行增菌。 7.1.2.2 平面样品 无菌操作将灭菌规格板(5 cm5 cm)放在平面垫料表面,用浸有无菌稀释液(无菌0.85 %生理盐水)的棉拭子,在规格板内来回均匀涂抹整个方格 3 次,并随之转动棉拭子,然后用灭菌剪刀剪去棉样品制备 检样 25 g 或 25 cm2样液+225 mL mTSB 增菌 划线接种哥伦比亚
8、 CNA 血琼脂平板 挑取可疑菌落,接种哥伦比亚血琼脂平板和 TSB 革兰氏染色镜检/触酶试验 确定鉴定 36 1 ,18 h24 h 36 1 ,18 h24 h,厌氧培养 36 1 ,18 h24 h DB15/T 20712021 4 拭子与手接触的部分, 将棉拭子头置入装有 25 mL无菌稀释液 (无菌0.85 %生理盐水) 的无菌锥形瓶中,根据样品面积大小重复取样14个规格板面积, 相应地将棉拭子头置入25 mL100 mL的无菌稀释液 (无菌0.85 %生理盐水)中,充分振摇制成样品原液(1 mL原液对应的样品面积为1 cm2)。取25 mL样品原液加入225 mL mTSB,充分
9、振摇或均质1 min2 min,置36 1 培养18 h24 h进行增菌。 表1 不同面积平面类垫料样品取样量 样品面积 m2 取样量 cm2 规格板数 小于0.25(含) 25 1 0.250.5(含) 50 2 0.50.75(含) 75 3 大于0.75 100 4 7.2 分离培养 将增菌液划线接种于哥伦比亚CNA血琼脂平板,36 1 厌氧培养18 h24 h,观察菌落形态。溶血性链球菌在哥伦比亚CNA血琼脂平板上的典型菌落形态为直径约2 mm3 mm,灰白色、半透明、光滑、表面突起、圆形、边缘整齐,并产生型溶血。 7.3 鉴定 7.3.1 分纯培养 挑取5个 (如小于5个则全选) 可
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