DB35_T+2132-2023+实验用秀丽隐杆线虫饲育技术.docx
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1、ICS 07.08035CCS B 44福建省地方标准DB35/T 21322023实验用秀丽隐杆线虫 饲育技术Experimental Caenorhabditis elegansRearing technique2023 - 10 - 25 发布2024 - 01 - 25 实施福建省市场监督管理局发 布DB35/T 21322023目次前言II1 范围12 规范性引用文件13 术语和定义14 人员15 环境与设施26 引种与保种27 繁育38 饲养49 消毒与感染防控610 废弃物处理611 记录与档案6附录 A(资料性) 仪器设备及耗材7附录 B(资料性) 培养基及试剂9附录 C(资料
2、性) 雄虫及雌雄同体虫的形态结构图11附录 D(资料性) 线虫的生长周期13附录 E(资料性) OP50 的培养14附录 F(资料性) 线虫易感染的微生物和寄生虫15参考文献16I前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由福建上源生物科学技术有限公司提出。本文件由福建省科技厅归口。本文件起草单位:福建上源生物科学技术有限公司、福建农林大学、福建师范大学。本文件主要起草人:赵培、张壬辉、陈岚彬、张积森、林晨韬、郑惠、卞文印、蔡栋灵。DB35/T 21322
3、023实验用秀丽隐杆线虫 饲育技术1 范围本文件规定了实验用秀丽隐杆线虫(以下简称“线虫”)饲育过程中人员、环境与设施、引种与保种、繁育、饲养、消毒与感染防控、废弃物处理、记录与档案等技术要求。本文件适用于实验用秀丽隐杆线虫的饲育。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 66822008 分析实验室用水规格和实验方法GB 149252010 实验动物 环境及设施GB/T 347912017 实验动物 质量控制要求JG/T
4、292 洁净工作台SN/T 4835 实验室生物废弃物管理要求3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。秀丽隐杆线虫 Caenorhabditis elegans秀丽隐杆线虫属于线形动物门(Nemathelminthes),线虫纲(Nematoda),小杆线虫目(Rhabditida),广杆线虫属(Caenorhabditis),食细菌的线形动物,对人体无毒无害,安全的实验动物。大肠埃希氏菌 OP50 Escherichia coli OP50(E. coli OP50)尿嘧啶缺陷型大肠杆菌。幼虫期线虫 larval phase Caenorhabditis elegans未性成熟的线虫,分为
5、一龄(L1)、二龄(L2)、三龄(L3)、四龄(L4)四个时期。耐受期线虫 dauer phase Caenorhabditis elegansL2时期线虫在逆境条件下发育而成的滞育线虫。4 人员 一般要求15按照GB/T 347912017中规定的人员技术指标执行。 管理人员包括设施负责人、技术负责人和质量负责人,应经过专业培训,掌握线虫的生理、生态习性和专业知识,满足岗位技能要求。 饲育人员身体健康,并接受过专业培训,熟练掌握操作技能。5 环境与设施 设施设施的外部环境、工艺布局及其暖通空调、给排水、供电照明、通讯监控、消防等按GB 149252010 中普通环境的要求执行。 设备及试剂耗
6、材饲育所需的仪器设备及耗材见附录A。 区域布局5.3.1 布局各区域之间应规定合理的人员流动路线,辅助功能区和饲育区应分开。5.3.2 辅助功能区包括称量区、灭菌区、制板区、食物制备区、废弃物品处理区等。5.3.3 饲育区用于线虫饲养繁育的区域。 环境5.4.1 技术指标饲育区环境指标按照GB 149252010的相关规定执行。5.4.2 监测方法设施环境指标监测方法按照GB 149252010的相关规定执行。6 引种与保种 引种满足以下要求:应从正规种质资源库进行引种,以获取遗传背景明确的线虫种质资源;引种过程应建立包括种名、来源、引种日期等信息的档案;境外引种时应按国家相关规定执行。 保种
7、6.2.1 线虫的选取应选取L1幼虫期线虫或耐受期线虫进行长期保种。6.2.2 保种条件温度低于80 。6.2.3 保种方法线虫的保种应采用超低温冻存技术,应满足以下要求:冻存液选用 S 缓冲液 1 和含有 30甘油的 S 缓冲液 2,详细配方见附录 B;冻存器材选用冻存管、梯度降温盒;冻存液中收集的线虫密度宜为每 1 ml 冻存液中包含 6001 000 只线虫,每支冻存管中分装 1 mL;冻存管在80 冰箱的临时保存区梯度降温至80 ;冻存管梯度降温完成后转移至80 冰箱或液氮罐的长期保存区。6.2.4 冻存合格检测标准冻存24 h后,取同一批次冻存的线虫,在37 半融化后,迅速转移到线虫
8、生长培养基(NGM)培养皿中观察,复苏后的线虫存活率应高于20。6.2.5 保种年限根据需求,宜选择以下方式进行保存:在80 冰箱能保存 10 年;在液氮中能长期保存。7 繁育自体受精繁育线虫有雄性及雌雄同体两种性别。雌雄同体虫既能产生精子,又能产生卵子,可以在无雄虫存在的情况下进行自体受精繁育。 交配繁育7.2.1 交配线虫的选取7.2.1.1 雄虫体长约为0.8 mm,在22 培养条件下培养3天的年轻雄虫(附录C)。在正常培养条件下,雄虫在群体中的比例为13。为获取足够的交配雄虫,宜将L4幼虫期线虫中的雌雄同体线虫置于30 条件下热激6 h8 h,后代中将产生23的雄虫。7.2.1.2 雌
9、雄同体整体外观符合线虫的显微形态学表型的年轻雌雄同体成虫(附录C)。7.2.2 交配原则应满足以下要求:雄虫和雌雄同体的比例按为 11 或 21;交配两天后,待培养皿中的子代发育到 L4 时期之前,将用于杂交的亲本雄虫尽数挑出。7.2.3 交配成功的判定交配成功时,后代中应有至少3雄虫。 繁育合格指标7.3.1 卵的质量卵为颗粒状,钝椭圆形,饱满且富有光泽;卵内幼胚应具备与发育时期一致的正常的显微形态学特征。7.3.2 生长周期22 且相对湿度范围为4080培养条件下线虫的生长周期如附录D所示。7.3.3 特征及表型繁育合格的线虫应满足以下要求:整体外观符合线虫的显微形态学表型(附录 C 和附
10、录 D);无行动障碍,爬行轨迹呈正弦曲线;L4 阶段的雌雄同体线虫在腹侧中心能看到一个清晰的半圆形亮斑;L4 阶段的雄虫尾部尖端向前扩展,至成虫发育为带交配器官的独特扇形尾部。7.3.4 繁殖能力每只雌雄同体虫自交产250300只后代,雄虫和雌雄同体虫杂交产9501 050只后代。8 饲养 固体饲养8.1.1 培养基及食物培养基及食物的要求如下:固体饲养应用 NGM 培养基(见附录 B);线虫以大肠埃希氏菌 OP50(以下简称OP50)为食,培养方法见附录 E。8.1.2 线虫转板根据需要,宜采用以下方式进行线虫转板:使用挑虫器在固体培养基上挑取线虫至新的 OP50-NGM 培养皿中;用灭菌的
11、解剖刀,从 OP50-NGM 培养皿中切取带线虫的琼脂块,置于新的 OP50-NGM 培养皿中。8.1.3 容器选择根据实验需求,宜选3.5 cm、6 cm、9 cm等大小的培养皿。8.1.4 饲养密度每1 cm2 OP50菌苔上饲养的线虫数量宜为2只,培养3 d5 d 后(食物耗尽前)进行转板。 液体饲养8.2.1 培养液及食物培养液及食物的要求如下:液体饲养应用 S 培养基(见附录 B);线虫以 OP50 为食,培养方法见附录 E。8.2.2 线虫转移应使用移液器进行转移,且移液器的吸头宜为玻璃材质。8.2.3 容器选择根据实验需求,宜选无菌三角瓶、无菌24孔板、96孔板等。8.2.4 饲
12、养密度饲养密度满足以下要求:每 1 mL S 培养基中添加 50 mg 的 OP50,能供 2 只线虫生长 3 d5 d;培养过程应注意观察线虫生长状况,并根据需要在食物耗尽前添加 OP50 或进行转移。 饲养的技术指标8.3.1 操作要求操作符合以下要求:挑取线虫时,动作应轻柔细致,从线虫的腹侧下方轻轻挑取,避免挑虫器损伤线虫;每次挑取线虫前,挑虫器应在酒精灯火焰上灼烧灭菌,冷却 3 s5 s 后使用;线虫的转板及转移操作应在洁净工作台中进行。8.3.2 饲养条件饲养的各类条件应符合以下要求:生长温度在 15 25 之间,最常使用的培养温度是 20 ;相对湿度在 4080;光照不超过 30
13、lx;固体饲养的线虫置于洁净的恒温培养箱中,液体饲养的线虫置于恒温摇床中,恒温摇床的震荡频率为 100 r/min200 r/min。9 消毒与感染防控 消毒管理定期对设施设备进行清洁消毒。 微生物与寄生虫处理在人工饲育过程中,如线虫表现出被微生物或寄生虫感染的表型,对感染线虫进行销毁处理。线虫易感染的微生物和寄生虫见附录F。10 废弃物处理产生的生物废弃物和污水按照SN/T 4835的规定进行无害化处理,其他实验室废弃物按照相关规定进行处理。11 记录与档案记录记录培养温度、相对湿度、线虫发育情况等。 标识饲育容器应标记饲育日期、繁育方法、饲育条件等。 档案应满足以下要求:建立人员培训计划和
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