DB22-T3455-2023分蘖洋葱中洋葱黄矮病毒检测 实时荧光PCR法.docx
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1、ICS 65.020CCS B 05DB22吉林省地方标准DB 22/T 34552023 分蘖洋葱中洋葱黄矮病毒检测 实时荧光PCR 法Detection of onion yellow dwarf virus by real-time PCR on Shallot 2023 - 02 - 27 发布2023 - 03 - 27 实施吉林省市场监督管理厅发 布 DB22/T 34552023前言本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第 1 部分:标准化文件的结构和起草规则和GB/T 20001.42015标准编写规则 第 4 部分:化学分析方法的规定起草。 请注意本文件中的某些
2、内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由吉林省农业农村厅提出并归口。 本文件起草单位:吉林省农业科学院。 本文件主要起草人:李小宇、张春雨、王海鹏、王永志、苏颖、李建平、张金花、杨阳、于红。I DBXX/ XXXXXXXXX分蘖洋葱中洋葱黄矮病毒检测 实时荧光 PCR 法警告使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施,并保证符合国家有关法规规定的条件。 1 范围本文件描述了分蘖洋葱中洋葱黄矮病毒实时荧光 PCR 检测方法。本文件适用于分蘖洋葱中洋葱黄矮病毒的检测。 2 规范性引用文件下列文件中的内
3、容通过中文的规范性引用而构成本文件的必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅注日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 28067 甘蔗黄叶病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法 3 术语和定义GB/T 28067 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原 理比对洋葱黄矮病毒外壳蛋白基因,设计一对仅在洋葱黄矮病毒外壳蛋白基因间保守的特异性引物。提取分蘖洋葱总 RNA,在反转录酶作用下反转录成 cDNA,并以其为模板,利用 Taq 酶进行实时荧光 PCR 扩增反应(采用 SYBR
4、 Green 荧光染料方法)。SYBR Green 是一种具有绿色激发波长的染料,能够与双链 DNA 小沟区域结合。游离状态的 SYBR Green 只发出微弱的荧光,当与双链 DNA 结合后, 荧光强度会显著增加,而且荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。 5 试剂或材料5.1 试剂5.1.1 水:符合 GB/T 6682-2008 中一级水的要求。 5.1.2 Trizol 核酸提取试剂盒。 5.1.3 反转录试剂盒。 5.1.4 实时荧光 PCR 试剂盒。 5.1.5 DEPC(焦炭酸二乙酯 Diethy Pyrocarbonate)。 5.1.6 三氯甲烷。 1 5.1.7 异丙醇。 5
5、.1.8 无水乙醇。 5.1.9 DEPC 处理的水。 5.1.10 DEPC 处理的 75%乙醇:无水乙醇(含量99.8%)与 DEPC 处理的水按 31 的体积比配置。 5.2 引物5.2.1 引物序列上游引物:5-GCACGTTACGCATTCGACTT-3 下游引物:5-GCCTTCATCTGCATGTGTG-3 5.2.2 引物配制引物用水稀释成 10 mol/L,-20 保存备用。 6 仪器设备6.1 实时荧光 PCR 仪。 6.2 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.3 电子天平:感量 0.01 g。 6.4 高速冷冻离心机:离心力 12000 g 以上。 6.5 微量移液器:
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