SN∕T 5516.9-2023 出口食品中致病菌荧光重组酶介导链替换核酸扩增(RAA)检测方法 第9部分:单核细胞增生李斯特氏菌.pdf
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1、I C S0 7.1 0 0.3 0C C SX0 4中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 5 1 6.92 0 2 3 出口食品中致病菌荧光重组酶介导链替换核酸扩增(R A A)检测方法第9部分:单核细胞增生李斯特氏菌R e a l-t i m e r e c o m b i n a s e-a i d a m p l i f i c a t i o n d e t e c t i o n m e t h o d f o r p a t h o g e n s i n e x p o r t f o o dP a r t 9:L i s t e r i a m o n o c y
2、 t o g e n e s2 0 2 3-0 5-0 5发布2 0 2 3-1 2-0 1实施中华人民共和国海关总署发 布前 言 本文件按照G B/T 1.12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。本文件是S N/T 5 5 1 6 出口食品中致病菌荧光重组酶介导链替换核酸扩增(R AA)检测方法 的第9部分。S N/T 5 5 1 6已经发布了以下部分:第1部分:沙门氏菌;第2部分:志贺氏菌;第3部分:金黄色葡萄球菌;第4部分:副溶血性弧菌;第5部分:克罗诺杆菌属;第6部分:大肠埃希氏菌O 1 5 7;第7部分:产志贺毒素大肠埃希氏菌;第8部分:空
3、肠弯曲菌;第9部分:单核细胞增生李斯特氏菌;第1 0部分:小肠结肠炎耶尔森氏菌;第1 1部分:肺炎克雷伯氏菌;第1 2部分:铜绿假单胞菌;第1 3部分:蜡样芽孢杆菌;第1 4部分:产气荚膜梭菌;第1 5部分:霍乱弧菌;第1 6部分:创伤弧菌。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国上海海关、中华人民共和国石家庄海关、中国海关科学技术研究中心、上海海洋大学。本文件主要起草人:黄新新、何宇平、王建昌、谢小珏、曾静、魏海燕、张西萌、郭德华、赵勇、孙晓红。S N/T5 5 1 6.92 0 2 出
4、口食品中致病菌荧光重组酶介导链替换核酸扩增(R A A)检测方法第9部分:单核细胞增生李斯特氏菌1 范围本文件规定了出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌的荧光重组酶介导链替换核酸扩增(R AA)检测方法。本文件适用于出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌的快速筛选。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B 4 7 8 9.3 0 食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和
5、试验方法G B 1 9 4 8 9 实验室 生物安全通用要求G B/T 2 7 4 0 3 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测3 术语、定义和缩略语3.1 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。实时荧光R A A r e a l t i m e R A AR AA是一种核酸恒温扩增技术,在恒温下(一般为3 7 -4 2),重组酶和寡核苷酸引物结合形成蛋白-D NA复合物,该复合物能够移动寻找模板D NA中的同源序列,在单链D NA结合蛋白的帮助下,打开模板D NA的双链结构,在D NA聚合酶的作用下,形成新的双链,产物呈指数级扩增。在e x o探针中包含一个四氢呋喃残基(THF),其两侧分
6、别为d T-荧光基团(F AM)和d T-淬灭基团(BHQ-1)。探针3 端通过适当的修饰(C 3 S p a c e r)被封闭,以阻止聚合酶的进一步延伸。只有当探针和目的D NA结合后,核酸外切酶I I I(E x o n u c l e a s e I I I,E x o I I I)能够识别并切除THF残基,并解除3 端阻断,荧光基团和淬灭基团分开并产生荧光信号,R AA产物与荧光信号的增长存在对应关系。3.2 缩略语下列缩略语适用于本文件。B HQ 1:黑洞淬灭基团1(b l a c k h o l e q u e n c h e r 1)D NA:脱氧核糖核酸(d e o x y
7、r i b o n u c l e i c a c i d)d NT P:脱氧核糖核苷三磷酸(d e o x y r i b o n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e)E x o I I I:核酸外切酶 I I I(E x o n u c l e a s e I I I)1S N/T5 5 1 6.92 0 2 F AM:6-羧基荧光素(6-c a r b o x y f l u o r e s c e i n)h l y A基因:溶血素(h e m o l y s i n)P E G:聚乙二醇(p o l y e t h y l e n e
8、g l y c o l)R AA:重组酶介导链替换核酸扩增(r e c o m b i n a s e-a i d a m p l i f i c a t i o n)T r i c i n e:三(羟甲基)甲基甘氨酸(N-T r i s(h y d r o x y m e t h y l)m e t h y l g l y c i n e)4 技术概要以提取的D NA为模板,采用单核细胞增生李斯特氏菌特异性R AA引物和e x o探针,进行实时荧光R AA的扩增,根据实时荧光R AA的增幅情况,实现对食品中单核细胞增生李斯特氏菌的快速筛选。5 试剂和材料除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂,
9、实验用水符合G B/T 6 6 8 2一级水的要求。所有试剂均用无D NA酶污染的容器分装。5.1 检测用引物(对)序列和探针根据单核细胞增生李斯特氏菌h l y A基因设计的上下游引物和一条e x o探针,详见表1。表1 引物和探针序列名称序列(5 -3)目的基因上游引物h l y-FC G C AA T C AG T GAAG G GAAAA T G C AAGAAGAAG T C下游引物h l y A-RT T G C AA C T G C T C T T TAG TAA C AG C T T T G C C GAAAe x o探针h l y-PTAG T T T TAAA C AAA
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