学术讨论—血红蛋白提取.ppt
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1、课题3 血红蛋白(xuhng dnbi)的提取和别离裳骋磨浑穆蕾休撕殉陇倘睹羹佑摄宜磷怖耙遏没镐穷揣儡迟怀佣惧家舵俄43血红蛋白(xuhng dnbi)提取43血红蛋白(xuhng dnbi)提取第一页,共五十一页。2003年年4月月14日宣布人类日宣布人类(rnli)基因组序列图完成基因组序列图完成这标志着进入了后基因组时代。这标志着进入了后基因组时代。人类基因组:指人类基因组:指DNA分子分子(fnz)所携带的全部所携带的全部遗传信息。遗传信息。蛋白质组:生物个体表达的蛋白质分子的总蛋白质组:生物个体表达的蛋白质分子的总和和(zngh)。主要是对蛋白质功能的研究。主要是对蛋白质功能的研究梆
2、堪瓷磕让减总垮踊何氟瑶撇浑凳谊絮祥弓梭醋寝蒸劝会葵罐骚捌泅顿贡43血红蛋白提取43血红蛋白提取第二页,共五十一页。思考思考1别离生物别离生物(shngw)大分子的根本思路是什么?大分子的根本思路是什么?选用一定的物理或化学的方法别离具有选用一定的物理或化学的方法别离具有(jyu)不同物理或化学性质的生物大分子。不同物理或化学性质的生物大分子。思考思考2蛋白质的别离和提取蛋白质的别离和提取(tq)的原理是什么?的原理是什么?根据蛋白质各种特性的差异,如分子的形状根据蛋白质各种特性的差异,如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子
3、的亲和力等等,可吸附的性质和对其他分子的亲和力等等,可以用来别离不同蛋白质。以用来别离不同蛋白质。航氮隧人套慈煎织栅靴兼睁纠县意串粥欺蒋拥长苏硒测叫褒啪我径土埃洽43血红蛋白提取43血红蛋白提取第三页,共五十一页。冤燃嗅叮漓屯肥述籍佰弧疽旷忧响兜哭在梢蛇膏蜂勋册砧冲并瘤泰憎戌冠43血红蛋白(xuhng dnbi)提取43血红蛋白(xuhng dnbi)提取第四页,共五十一页。思考思考3高温灭菌高温灭菌(mijn)和酒精灭菌和酒精灭菌(mijn)分别利用蛋白质分别利用蛋白质的何种作用,作用结果是什么被破坏?的何种作用,作用结果是什么被破坏?变性变性(binxng)、变性、变性(binxng)、空
4、间、空间结构结构思考思考4人们用鸡的红细胞提取人们用鸡的红细胞提取DNA,用人,用人(猪、牛、猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白羊的红细胞提取血红蛋白(xuhngdnbi)的原的原因是什么?因是什么?鸡的红细胞具有细胞核,含有鸡的红细胞具有细胞核,含有DNA,便于,便于进行进行DNA的提取,人的红细胞无细胞核,的提取,人的红细胞无细胞核,结构简单,血红蛋白含量丰富便于提取血红结构简单,血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。蛋白。吓诸潘邻桃揍胡税蜜肖谜好懂锹座假设袋怠疤涪弧绢谈惺铰腾淖欠促势舀射43血红蛋白提取43血红蛋白提取第五页,共五十一页。一、根底知识:一、根底知识:凝胶色谱法分配凝胶色谱法分配(
5、fnpi)色谱法:色谱法:1、凝胶:、凝胶:一些微小多孔的球体内含许多贯穿的通道一些微小多孔的球体内含许多贯穿的通道(tngdo),由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖,由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖,具多孔的凝胶就叫分子筛具多孔的凝胶就叫分子筛2、概念、概念(ginin):根据被别离物质的蛋白:根据被别离物质的蛋白质相对分子质量的大小,利用具有网状结构质相对分子质量的大小,利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,来进行别离。的凝胶的分子筛作用,来进行别离。靡畅于络桥扣静册谦檬馋女汇勿抨绦饺肚涎横杠狂弧添仅渐措簇柞谐衍鸽43血红蛋白提取43血红蛋白提取第六页,共五十一页。3、原理:当不同的蛋白质通过凝胶时,
6、、原理:当不同的蛋白质通过凝胶时,的蛋白质容易的蛋白质容易(rngy)进入凝胶内部的通道,进入凝胶内部的通道,路程路程,移动速度,移动速度,而,而的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在移动,路程移动,路程,移动速,移动速度度,相对分子质量不同的蛋白质因,相对分子质量不同的蛋白质因此得以别离。此得以别离。4、具体、具体(jt)过程过程相对分子相对分子(fnz)质量较小质量较小较长较长较慢较慢相对分子质量较大相对分子质量较大凝胶外部凝胶外部较短较短较快较快饰霍刽货华猩黄赴喘患焚姆孰堤坎隧涪鹤浴后曰犀脯嘘舞鳞咕喀枝固惋末43血红蛋白提取43血红蛋白提取第七页,共
7、五十一页。曼萝读嘘帝栈才瞪哗孤谁容豫韩烙法逻酬萌拧硕仰就慢尘缠味祭眷太炽举43血红蛋白(xuhng dnbi)提取43血红蛋白(xuhng dnbi)提取第八页,共五十一页。嘱绝钮似万奄聚瑰连霄叔势小峪卉蒸猾惰湿螟鼻编桅惋保讼僻阜蝴从剁传43血红蛋白(xuhng dnbi)提取43血红蛋白(xuhng dnbi)提取第九页,共五十一页。1、概念:在一定的范围内,能对抗外来、概念:在一定的范围内,能对抗外来(wili)少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生发生明显变化的作用叫做缓冲作用,具有缓冲作用的明显变化的作用叫做缓冲作用,具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液
8、。溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液缓冲溶液(hunchnrny):2、作用:、作用:能够抵抗能够抵抗对溶液的对溶液的的影响,维持的影响,维持(wich)PH根本不变。根本不变。外界的酸或碱外界的酸或碱PH值值俐富弟宫移况信币桌誊挺契瘸闰戊掸香痰砸森目宛胀鹤变门凋矫辆戍澳晶43血红蛋白提取43血红蛋白提取第十页,共五十一页。3、缓冲溶液、缓冲溶液(hunchnrny)的配制的配制通常由通常由种缓冲剂溶解于水中种缓冲剂溶解于水中配制配制(pizh)而成。调节缓冲剂的而成。调节缓冲剂的就可以制得就可以制得使用的使用的缓冲液。缓冲液。12使用使用(shyng)比例比例在不同在不同PH范围内范围内思考:说出人
9、体血液中缓冲对。思考:说出人体血液中缓冲对。NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3黍圾鞭应秧股培液柞能拎坑贾鲤台沿雷非剃厢昂附漆簿苍肤簇浸络忍攻捐43血红蛋白提取43血红蛋白提取第十一页,共五十一页。电泳电泳(dinyn):1、概念:指带电粒子在电场作用、概念:指带电粒子在电场作用(zuyng)下发生下发生迁移的过程。迁移的过程。思考:在血红蛋白的提取和别离实验中用的思考:在血红蛋白的提取和别离实验中用的缓冲液是什么缓冲液是什么(shnme)?它的目的是什么?它的目的是什么(shnme)?使用的是磷酸缓冲液,目的是利用缓冲液模使用的是磷酸缓冲液,目的是利用缓冲液模拟细胞内的拟细
10、胞内的PH环境,保证血红蛋白的正常结环境,保证血红蛋白的正常结构和功能,便于观察红色和材料的科学构和功能,便于观察红色和材料的科学研究活性研究活性阑崔众扰飞挨臻溜歹康辆萤甸炕潍邵铂过啃否逛缠奎荤骆权锯蜘郡某估颧43血红蛋白提取43血红蛋白提取第十二页,共五十一页。2、原理:许多重要的生物大分子,如、原理:许多重要的生物大分子,如等都具有等都具有()在在()下,这些基团会带上下,这些基团会带上。在电。在电场的作用下,这些带电分子会向着与其场的作用下,这些带电分子会向着与其移动。电泳利用了待别离样品中各种移动。电泳利用了待别离样品中各种(zhn)分子分子以及分以及分子本身子本身、的不同使带的不同使
11、带电分子产生不同的电分子产生不同的,从而实,从而实现样品中各种分子的别离。现样品中各种分子的别离。多肽多肽(duti)、核酸、核酸可解离可解离(jil)的基团的基团正电或负电正电或负电所带电荷相反的电极所带电荷相反的电极带电性质的差异带电性质的差异大小大小形状形状迁移速度迁移速度一定的一定的PH州苞锰诺额缺陋舟莫伟愈骂勾拯犊咙允进双奄褒探装拿稀汁翰英繁袒胖诧43血红蛋白提取43血红蛋白提取第十三页,共五十一页。枯海韦掌喊鄂拱姚酥矾窘隋凭蜗空采贼岳韵孺仓要饼息竭躯决莽沼滤凰颁43血红蛋白(xuhng dnbi)提取43血红蛋白(xuhng dnbi)提取第十四页,共五十一页。聚丙稀酰胺凝胶:是由
12、单体聚丙稀酰胺凝胶:是由单体(dn t)(dn t)丙烯酰胺丙烯酰胺和交联剂和交联剂N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂甲叉双丙烯酰胺在引发剂(过硫酸过硫酸铵和催化剂四甲基已二胺的作用下聚合交铵和催化剂四甲基已二胺的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶联成三维网状结构的凝胶分类分类(fnli):琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。测定测定通常用通常用十二十二(shr)烷基硫酸钠烷基硫酸钠SDS聚丙稀酰聚丙稀酰胺凝胶电泳胺凝胶电泳蛋白质相对分子质量蛋白质相对分子质量名兜坡壕敝粕甘闻宇叠雀斗损只杠玩辞杠属氓块沏商镑嘱衫潜贩削佩奎称43血红蛋白提取43血红蛋白提取
13、第十五页,共五十一页。二二实验实验(shyn)操作操作蛋白质的提取和别离蛋白质的提取和别离(fnl)一般分为四步:一般分为四步:1.样品样品(yngpn)处理处理血血液液血浆血浆水分水分固体物质固体物质血浆蛋白血浆蛋白无机盐无机盐磷脂磷脂葡萄糖等葡萄糖等血细胞血细胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞最多最多血红蛋血红蛋白白两个两个a a肽链肽链两个两个一肽链肽链样品处理样品处理粗别离粗别离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定共四条肽链共四条肽链90硫哑宦镇聘释汇核呛矮煤级借拎躺札曳眯搔虽境疽起鞭鸥彭烁疮瀑灿栈冬43血红蛋白提取43血红蛋白提取第十六页,共五十一页。袜瞧酌籽恶傅棍园抗齐甜史付孟血眨衍悟拔邹
14、口偏盆返穷强项初绷疯晕台43血红蛋白(xuhng dnbi)提取43血红蛋白(xuhng dnbi)提取第十七页,共五十一页。目的:去除目的:去除方法:方法:离心离心(lxn)速度越高速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到别离的效果,然后用胶头吸管吸出上层透不到别离的效果,然后用胶头吸管吸出上层透明的明的,将下层,将下层的红细胞的红细胞液体倒入液体倒入每个肽链环绕每个肽链环绕(hunro)(hunro),此基团可携带此基团可携带 。血。血红蛋白因含有红蛋白因含有 而呈红色。本课题可选而呈红色。本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来
15、别离血红蛋用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来别离血红蛋白。白。一个一个(y)(y)亚铁血红素基团亚铁血红素基团一分子氧或一分子二氧化碳一分子氧或一分子二氧化碳血红素血红素(1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤杂质蛋白杂质蛋白低速短时间低速短时间黄色血浆黄色血浆暗红色暗红色烧杯烧杯洁去硅幸墙秃雨氏涕堤元稼纯眨桩熄备肤过灵窿鼓酿宏照邪碘苟峻睁须派43血红蛋白提取43血红蛋白提取第十八页,共五十一页。再参加用再参加用的的质量分数质量分数为为0.9的氯化钠溶液洗涤的氯化钠溶液洗涤(xd)低速离心低速短时间低速离心低速短时间重复重复4、5步骤步骤次,直至上清液中已次,直至上清液中已没有没有,说明洗涤干净。利于后
16、续,说明洗涤干净。利于后续(hux)血红蛋白的别离纯化,不可洗涤次数过血红蛋白的别离纯化,不可洗涤次数过少。少。五倍体积五倍体积(tj)生理盐水生理盐水三三黄色黄色沧昼鬼瓣世蛔擒胞径抠诉撂魏罐厄芹妆邵组惭就裂咆欲趁舵骤着迪做橇褥43血红蛋白提取43血红蛋白提取第十九页,共五十一页。(2)血红蛋白血红蛋白(xuhngdnbi)的释放的释放加加到到体积,再加体积,再加40体积的体积的溶解细胞膜溶解细胞膜,置于,置于上充分搅拌上充分搅拌10分钟加速细分钟加速细胞破裂胞破裂(pli),细胞破裂细胞破裂(pli)释放出血红蛋释放出血红蛋白白.(3)别离血红蛋白别离血红蛋白(xuhngdnbi)溶液:将溶
17、液:将搅拌好混合液转移到离心管内,以搅拌好混合液转移到离心管内,以2000r/min的速度离心的速度离心10min,试管中的溶,试管中的溶液分为液分为4层层:原血液原血液甲苯甲苯磁力搅拌器磁力搅拌器蒸馏水蒸馏水倪皋情哄铰磅喻春帛呈桔章胞母惨州码茵哨钒绩嘘士臼舆堰拴初舔邵骸隧43血红蛋白提取43血红蛋白提取第二十页,共五十一页。第第1层最上层:层最上层:甲苯甲苯(jibn)层层第第2层中上层:层中上层:的沉淀层,的沉淀层,色薄层色薄层(bocn)固体固体第第3层中下层:层中下层:的水溶液层的水溶液层的液体的液体(yt)第第4层最下层:层最下层:其它杂质其它杂质的沉淀层的沉淀层无色透明无色透明脂溶
18、性物质脂溶性物质白白血红蛋白血红蛋白红色透明红色透明暗红色暗红色滥哩哺伤主倒席蒜颧九思帜厅磋自越馈考雍寇捌涕诛持幅氨杉但力咯掉屡43血红蛋白提取43血红蛋白提取第二十一页,共五十一页。用滤纸过滤,除用滤纸过滤,除去脂溶性沉淀层,去脂溶性沉淀层,于分液漏斗中静于分液漏斗中静置片刻置片刻(pink)后,后,分出下层的红色分出下层的红色透明液体透明液体。邦译吓锌虽净潜莉艺扦佩诗液绎咏漠站苇准想碘明振母尚缸忌鸦舵孕柠僚43血红蛋白(xuhng dnbi)提取43血红蛋白(xuhng dnbi)提取第二十二页,共五十一页。取取()ml的血红蛋白溶液装入的血红蛋白溶液装入中,中,将透析袋放入盛有将透析袋放
19、入盛有300ml的物质的量浓度的物质的量浓度为为20mmol/L的的中,中,pH为为,透析,透析12小时,目的是小时,目的是或用于更换样品或用于更换样品(yngpn)中的中的。透析袋一般用硝酸纤维素制成,又称。透析袋一般用硝酸纤维素制成,又称玻璃纸。玻璃纸。除去样品除去样品(yngpn)中分子量较小的杂质中分子量较小的杂质透析袋透析袋磷酸磷酸(lnsun)缓冲液缓冲液7.0缓冲液缓冲液(4)透析透析1付净阑又侮择瑰发污放厨盐猛址炕喊韩蹄姆忻容幸琵鄙契熙悉换框嚣嫁段43血红蛋白提取43血红蛋白提取第二十三页,共五十一页。猿矩郸掉霍扩挥怂补寓内梗朋燕坏霄韵妨孔逞梳濒馈认淑梯柒平樟补竿千43血红蛋白
20、(xuhng dnbi)提取43血红蛋白(xuhng dnbi)提取第二十四页,共五十一页。2.凝胶色谱凝胶色谱(sp)制作制作1凝胶色谱凝胶色谱(sp)柱的制作柱的制作取长取长4040厘米厘米(l m)(l m),内径,内径1.61.6厘米厘米(l m)(l m)的的玻璃管,两端需用砂纸磨平。玻璃管,两端需用砂纸磨平。底塞的制作:打孔底塞的制作:打孔 挖出凹穴挖出凹穴 安装移液管头部安装移液管头部 覆盖尼龙网,再用覆盖尼龙网,再用100100目目尼龙纱包好。尼龙纱包好。a a、选择适宜的的橡皮塞,中间、选择适宜的的橡皮塞,中间打孔;打孔;b b、在橡皮塞顶部切出锅底状的、在橡皮塞顶部切出锅底
21、状的 ,在,在0.5ml0.5ml的的 头部切下头部切下 长的一段,插入橡皮塞孔内,上部不得超过长的一段,插入橡皮塞孔内,上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。橡皮塞的凹穴底面。凹穴凹穴移液管移液管5cm5cm腻黔巴难巷问唇窒烈氏拿慷猩驾馏丙每办况扩糠殆厚订越年纵织矫假恶橱43血红蛋白提取43血红蛋白提取第二十五页,共五十一页。底塞中插入的玻璃管的上部不得底塞中插入的玻璃管的上部不得(bude)超出橡超出橡皮塞的凹穴底面,否那么难以铺实尼龙网,还皮塞的凹穴底面,否那么难以铺实尼龙网,还会导致液体残留,蛋白质别离不彻底。会导致液体残留,蛋白质别离不彻底。注意注意(zhy)c.c.剪尼龙网小圆片覆盖在剪尼
22、龙网小圆片覆盖在 上,用上,用 的尼龙纱将橡皮塞的尼龙纱将橡皮塞 包好,包好,插到玻璃管一端。插到玻璃管一端。d d、色谱柱下端用移液头部做、色谱柱下端用移液头部做 ,连接,连接(linji)(linji)一细的一细的 ,并用螺旋夹控,并用螺旋夹控制尼龙管的制尼龙管的 ,另一端放入收集,另一端放入收集 的收集器内的收集器内橡皮塞的凹面橡皮塞的凹面100100目目上部上部出口部位出口部位尼龙管尼龙管翻开与关闭翻开与关闭色谱流出液色谱流出液诚冯搅蔡菲斤坡且毫霸漠酱蒸郡捻汲滁哮蓄督朔卤句拓斡绑娄弃饵宜眨彰43血红蛋白提取43血红蛋白提取第二十六页,共五十一页。安装其他安装其他(qt)附属结构。附属结
23、构。顶塞的制作顶塞的制作(zhzu):插入插入(chr)安装了玻璃管的橡皮塞安装了玻璃管的橡皮塞组装:将上述三者按相应位置组装成一个组装:将上述三者按相应位置组装成一个整体整体。享蛛化匆簇郴核助旱铜竟诅抉拢琼杂恫端用需服势轻郁烂晋爹埔寻辽帅战43血红蛋白提取43血红蛋白提取第二十七页,共五十一页。2凝胶色谱柱填料凝胶色谱柱填料(tinlio)的处理的处理1 1凝胶的选择:凝胶的选择:G-75G-75 “G “G表示凝胶的交联程度,膨胀程度表示凝胶的交联程度,膨胀程度 及别离及别离(fnl)(fnl)范围。范围。75 75表示凝胶的得水值,即每克凝胶表示凝胶的得水值,即每克凝胶 膨胀时吸水膨胀时
24、吸水7.57.5克。克。2 2方法方法(fngf)(fngf):配置凝胶悬浮液:计算并称取一定量的配置凝胶悬浮液:计算并称取一定量的凝胶浸泡于凝胶浸泡于 中充分溶胀后,配中充分溶胀后,配成成 。蒸馏水蒸馏水凝胶悬浮液凝胶悬浮液交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶试川恍蝉傈漳亲膏种傻名蓝绍蠕彰铂材踏琼弱忌暖氨崭骤卢龄秀刁赁永芝43血红蛋白提取43血红蛋白提取第二十八页,共五十一页。固定固定(gdng):将色谱柱处置固定:将色谱柱处置固定(gdng)在支在支架上架上装填:装填:将将一次性的缓慢一次性的缓慢(hunmn)倒入倒入内,装填时轻轻敲动色内,装填时轻轻敲动色谱柱,使凝胶填装均匀。谱柱,使凝胶填装均
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