学术讨论—脉冲场凝胶电泳.ppt
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1、第三章第三章核核酸酸技技术术第一页,共三十八页。核酸的分离和纯化核酸的分离和纯化核酸电泳核酸电泳染色体染色体DNA电泳电泳DNA限制酶切反应和限制酶谱绘制限制酶切反应和限制酶谱绘制(huzh)DNA的连接的连接PCR技术技术分子杂交技术分子杂交技术核酸序列的测定核酸序列的测定第二页,共三十八页。第一节第一节核酸核酸(hsun)的分离和纯化的分离和纯化第三页,共三十八页。一、一般程序一、一般程序1、供体的核酸分离、供体的核酸分离(fnl)供体细胞培养供体细胞培养收集收集(菌体菌体)细胞细胞细胞破碎细胞破碎分离分离总总DNA分离细胞器分离细胞器分离分离总总RNA分离分离细胞器细胞器DNARNApo
2、ly(A)RNA特异性特异性RNA染色体染色体DNA(组建基因组文库组建基因组文库)第四页,共三十八页。2、载体、载体DNA分离分离载体载体DNA感染或转染细胞(病毒型)感染或转染细胞(病毒型)转化细菌细胞(质粒型)转化细菌细胞(质粒型)分离病毒颗粒分离病毒颗粒(kl)培养转化细胞、收集菌体培养转化细胞、收集菌体病毒载体病毒载体DNA分离与纯化分离与纯化破碎细胞破碎细胞质粒质粒DNA分离与纯化分离与纯化3、DNA片段的分离片段的分离DNA限制酶切限制酶切凝胶电泳分离凝胶电泳分离特定特定DNA片段的回收片段的回收第五页,共三十八页。4、质量评估、质量评估1)凝胶电泳凝胶电泳2)光密度值测定)光密
3、度值测定3)限制酶切分析)限制酶切分析二、细胞裂解二、细胞裂解1.酶法:酶法:利用某些细胞壁裂解酶使细胞变为原生质体,然后加去垢利用某些细胞壁裂解酶使细胞变为原生质体,然后加去垢(qu)剂使原生剂使原生质体裂解。质体裂解。1)细菌:溶菌酶细菌:溶菌酶2)酵母:蜗牛酶、酵母:蜗牛酶、Novozyme234、glusulase、zymolase等等3)丝状真菌:丝状真菌:Novozyme234、溶壁酶、纤维素酶、溶壁酶、纤维素酶4)植物细胞:纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶植物细胞:纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶酶法裂解时要注意细胞的生长条件和生长时间,反应时尽可能满足酶酶法裂解时要注意细胞的生长条件和
4、生长时间,反应时尽可能满足酶的最佳反应条件。的最佳反应条件。第六页,共三十八页。2.机械法机械法1)压力剪切法:压力剪切法:French压力机,酵母细胞,细菌(芽孢和压力机,酵母细胞,细菌(芽孢和G+球菌球菌除外除外(chwi))2)射击破碎法:射击破碎法:Braun破碎机,搅切器(破碎机,搅切器(blender),混合器),混合器(mixer),),0.1-0.45mm玻璃球玻璃球3)固体研磨法:将待破碎细胞与玻璃球(固体研磨法:将待破碎细胞与玻璃球(0.10.45mm)同时致冷,在)同时致冷,在未融熔前用研杵磨成粉末未融熔前用研杵磨成粉末4)反复冻融法反复冻融法三、三、DNA的分离与纯化的
5、分离与纯化1、供体、供体DNA的分离与纯化的分离与纯化要求:尽可能地保持其高分子量,无其它污染物。要求:尽可能地保持其高分子量,无其它污染物。1)基因组大小:基因组大小:第七页,共三十八页。染色体染色体细菌细菌33004200kb酵母酵母(jiom)15,000kb果蝇果蝇1.28x105kb人人3x106kb植物植物2x1051x108kb天花病毒天花病毒288kb痘病毒痘病毒196kb质体质体几几100以上以上kb线粒体线粒体藻类藻类线状线状15kb酵母酵母环状环状1978kb植物植物(zhw)环状环状100150kb动物动物(扁虫到人扁虫到人)环状环状1518kb锥虫锥虫网状网状6000
6、kb(幼体幼体)短膜虫短膜虫网状网状30,000kb(幼体幼体)(Kinetoplast)叶绿体叶绿体双子叶植物双子叶植物121(菠菜(菠菜(bci))154kb(豌豆)(豌豆)单子叶植物单子叶植物151(玉米)(玉米)182kb(浮萍)(浮萍)藻类藻类132(裸藻)(裸藻)191kb(衣藻)(衣藻)第八页,共三十八页。1)DNA分离纯化过程分离纯化过程破碎细胞破碎细胞+DNA抽提液抽提液(EDTA、去污剂、还原剂、去污剂、还原剂)65温育温育20冰浴冷却冰浴冷却离心去细胞碎片离心去细胞碎片苯酚抽提法苯酚抽提法CsCl密度梯度离心密度梯度离心1)苯酚抽提法苯酚抽提法上清液上清液缓冲液用水饱和苯
7、酚抽提缓冲液用水饱和苯酚抽提23次次上层液相用氯仿抽上层液相用氯仿抽至界面无蛋白变性物至界面无蛋白变性物上层液相用两倍体积冷乙醇沉淀上层液相用两倍体积冷乙醇沉淀沉沉淀物用淀物用70%冷乙醇洗涤冷乙醇洗涤,干燥干燥溶于缓冲液溶于缓冲液加入加入RNAase处理处理除去除去RNA苯酚氯仿抽提苯酚氯仿抽提沉淀干燥沉淀干燥第九页,共三十八页。2)CsCl密度梯度离心密度梯度离心上清液上清液加入固体加入固体CsCl与与EtBr溶液溶液室温下超速离心室温下超速离心(45,000rpm)16小时小时穿孔取出穿孔取出DNA(320nm)异丙醇抽提溴乙异丙醇抽提溴乙锭锭缓冲液透析除去残余缓冲液透析除去残余CsCl
8、两倍体积冷乙醇沉淀两倍体积冷乙醇沉淀DNA离离心、洗涤、干燥心、洗涤、干燥*两种方法比较:两种方法比较:CsCl法操作步骤少,分离法操作步骤少,分离DNA分子量大,耗财多,且需超速离心机。分子量大,耗财多,且需超速离心机。苯酚法耗时少,不需昂贵仪器,但操作步骤多,易使苯酚法耗时少,不需昂贵仪器,但操作步骤多,易使DNA分子断裂。分子断裂。若若小心操作,所获小心操作,所获DNA亦符合要求。亦符合要求。*上述两种分离方法都包含了下述四个分离步骤上述两种分离方法都包含了下述四个分离步骤.可溶与不可溶物分离:高速离心除去细胞碎片,保留上清液。可溶与不可溶物分离:高速离心除去细胞碎片,保留上清液。.使蛋
9、白质分离:苯酚抽提或超速离心使蛋白质分离:苯酚抽提或超速离心.使使RNA分离:分离:RNase处理处理(chl)或超速离心或超速离心.使使DNA与其它可溶物分离与其它可溶物分离第十页,共三十八页。2.载体载体DNA的分离与纯化的分离与纯化1)质粒载体质粒载体DNA的分离的分离关键关键:如何:如何(rh)使质粒使质粒DNA与宿主染色体与宿主染色体DNA分开分开 原理原理:质粒:质粒DNA比染色体比染色体DNA小得多,在小得多,在DNA抽提过程中,染色抽提过程中,染色体体DNA断裂成小片段断裂成小片段(线状线状),质粒,质粒DNA仍保持超螺旋构型仍保持超螺旋构型3)细胞器细胞器DNA的分离的分离植
10、物组织植物组织用核分离缓冲液匀浆用核分离缓冲液匀浆过滤过滤滤液离心滤液离心(2000g,10,4)核缓冲液使核裂解核缓冲液使核裂解(含含0.5%TritonX-100)抽提抽提DNA植物组织植物组织细胞器缓冲液匀浆细胞器缓冲液匀浆离心离心(100g,10,4)除去细胞除去细胞核核离心离心(1800g,10,4)分离叶绿体分离叶绿体离心离心(10,000g,10,4)分离线粒体分离线粒体DNase除去细胞器外除去细胞器外DNA加入加入EDTA使使DNase失活失活纯化细胞器纯化细胞器细胞器裂解细胞器裂解提取提取DNA第十一页,共三十八页。方法:方法:.超速离心:利用两种超速离心:利用两种DNA分
11、子的大小和空间构型分子的大小和空间构型.变性法:在变性条件下使染色体变性法:在变性条件下使染色体DNA变为单链,而质粒变为单链,而质粒DNA仍保持仍保持环状结构,当变性条件发生环状结构,当变性条件发生(fshng)迅速变化时,前者仍不能复性,而后迅速变化时,前者仍不能复性,而后者又可回复到天然构型。者又可回复到天然构型。变性条件可采用加热煮沸法或碱变性法变性条件可采用加热煮沸法或碱变性法上述方法亦可用于上述方法亦可用于ss环状病毒环状病毒DNARF型的分离型的分离,质粒质粒DNA的的氯霉素扩氯霉素扩增增使用并不广泛(菌株和载体)使用并不广泛(菌株和载体)2)噬菌体载体噬菌体载体DNA的分离的分
12、离纯净病毒颗粒纯净病毒颗粒病毒载体病毒载体DNAM13mp载体可采用质粒载体可采用质粒DNA的分离方法的分离方法第十二页,共三十八页。二、二、RNA的分离与纯化的分离与纯化1.制备制备RNA的关键的关键防止内外源防止内外源RNase的作用的作用1)RNase的特点:抗酸抗碱的特点:抗酸抗碱,具很广具很广pH作用范围作用范围;抗高温严寒抗高温严寒(065均具活性);抗变性剂均具活性);抗变性剂2)解决办法:外源解决办法:外源RNase高温,焦磷酸二乙酯高温,焦磷酸二乙酯(DEPC)处理所有处理所有溶液(溶液(TrisHCl除外)和器皿,操作者带手套除外)和器皿,操作者带手套内源内源RNase高温
13、抽提,强蛋白质变性剂,高温抽提,强蛋白质变性剂,RNase抑制剂,蛋白酶抑制剂,蛋白酶K等等2.总总RNA的制备的制备根根据据所所用用蛋蛋白白质质变变性性剂剂种种类类不不一一样样分分为为以以下下三三种种(snzhn)制制备备方方法:法:1)热苯酚抽提法)热苯酚抽提法2)胍盐法:异硫氰酸胍和硫氰酸胍)胍盐法:异硫氰酸胍和硫氰酸胍3)LiCl/尿素法尿素法第十三页,共三十八页。其中以胍盐法最好,对于从那些其中以胍盐法最好,对于从那些RNase含量很高的组织(胰脏)中含量很高的组织(胰脏)中提取提取(tq)(tq)RNA特别有效,可使特别有效,可使RNase迅速变性,制备的迅速变性,制备的RNA有较
14、高翻有较高翻译活性。在译活性。在RNA制备中,细胞破碎与蛋白质变性是同步进行的。制备中,细胞破碎与蛋白质变性是同步进行的。3.多聚核糖体多聚核糖体RNA的制备的制备1)多聚核糖体的分离多聚核糖体的分离(fnl)超速离心法(超速离心法(30-40万万g,离心,离心2-3h)镁盐沉淀法(镁盐沉淀法(0.1MMg+)分级分离法分级分离法分离特异性多聚核糖体分离特异性多聚核糖体第十四页,共三十八页。i.结合与游离核糖体结合与游离核糖体的分离,这种方法可避免溶酶体破裂。的分离,这种方法可避免溶酶体破裂。ii.核糖体大小分级分离,利用连续密度梯度分离特大和特小的核糖体大小分级分离,利用连续密度梯度分离特大
15、和特小的多聚核糖体多聚核糖体iii.核糖体免疫沉淀法核糖体免疫沉淀法*直接免疫沉淀法直接免疫沉淀法新生肽链新生肽链+抗体抗体(kngt)蔗糖密度梯度离心蔗糖密度梯度离心 *间接免疫沉淀法间接免疫沉淀法 新生肽链新生肽链+抗体抗体+抗抗-抗体(二抗)抗体(二抗)不可不可 溶复合物溶复合物 离心分离离心分离 第十五页,共三十八页。*免疫亲和层析法免疫亲和层析法新生肽链新生肽链-抗体复合物抗体复合物不溶性交联抗原基不溶性交联抗原基质亲和层析柱吸附质亲和层析柱吸附洗脱洗脱免疫沉淀法优点:可分离到含量仅为免疫沉淀法优点:可分离到含量仅为1%的的mRNA,但必须使用高纯度,但必须使用高纯度的抗体,不能发生
16、的抗体,不能发生(fshng)交叉反应和污染核酸酶交叉反应和污染核酸酶2)多聚核糖体多聚核糖体RNA的分离的分离纯化多聚核糖体纯化多聚核糖体+SDS蔗糖密度梯度离心或蛋白酶蔗糖密度梯度离心或蛋白酶K-苯酚抽提苯酚抽提4.RNA的分级分离的分级分离1)分子量大小分级分离分子量大小分级分离i.蔗糖密度梯度离心蔗糖密度梯度离心ii.凝胶电泳凝胶电泳2)核酸序列分级分离核酸序列分级分离i.分子杂交法:适用于同源性很高的分子杂交法:适用于同源性很高的RNA的分离的分离DNA分子变性分子变性结合到结合到NCFRNADNA杂交杂交洗涤洗涤洗膜洗膜乙醇沉淀乙醇沉淀第十六页,共三十八页。ii.亲和层析法:亲和层
17、析法:低聚低聚dT纤维素纤维素:用于用于poly(A)较长的较长的mRNA;多聚多聚U琼脂糖琼脂糖:用于用于poly(A)较短的较短的mRNA(20A)RNA进样吸附进样吸附洗涤洗涤洗脱洗脱收集收集(shuj)260nm处吸收峰样品处吸收峰样品乙醇沉淀乙醇沉淀iii.无无poly(A)mRNA的分离的分离纯化多聚核糖体纯化多聚核糖体核糖体亚基核糖体亚基+mRNP离心离心mRNP蛋白酶蛋白酶KmRNA低聚(低聚(dT)纤维素层析)纤维素层析洗出液洗出液乙醇沉淀(无多聚乙醇沉淀(无多聚AmRNA)5.RNA的质量评估方法的质量评估方法1)光密度值测定法光密度值测定法A260/A280=2.02)凝
18、胶电泳凝胶电泳3)体外蛋白质翻译体外蛋白质翻译第十七页,共三十八页。细胞裂解物细胞裂解物胍盐法胍盐法总总RNA分子杂交法分子杂交法特异特异RNA分子分子热苯酚法热苯酚法凝胶电泳凝胶电泳围围RNA大小分级分离大小分级分离大小范大小范蔗糖密度蔗糖密度梯度离心梯度离心一定一定LiCl/核酸序列核酸序列尿素法尿素法离心离心分级分离分级分离亲和层析法亲和层析法poly(A)RNA分子分子高速离心法高速离心法全部多聚核糖体全部多聚核糖体上清液上清液镁盐沉淀法镁盐沉淀法蔗糖密度梯度离心蔗糖密度梯度离心结合与结合与游离多聚核糖体游离多聚核糖体分级分离法分级分离法蔗糖连续密度蔗糖连续密度一定范围大小核糖体一定范
19、围大小核糖体多聚核糖体多聚核糖体RNA免疫沉淀法免疫沉淀法特异性多聚核糖体特异性多聚核糖体第十八页,共三十八页。第二节第二节核核酸酸电电泳泳第十九页,共三十八页。1.种类种类1)按凝胶材料分按凝胶材料分:聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳(普通琼脂糖和低普通琼脂糖和低熔点琼脂糖熔点琼脂糖)2)按电泳装置分按电泳装置分:水平式水平式/琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶;竖式竖式/聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶3)两种方法比较:分离效果和分离范围两种方法比较:分离效果和分离范围;操作难易操作难易2.用途用途琼脂糖凝胶用于琼脂糖凝胶用于DNA和和RNA的常规的常规(chnggu)分析;聚丙
20、烯酰胺凝胶分析;聚丙烯酰胺凝胶常用于小分子核酸分析。常用于小分子核酸分析。3.凝胶电泳的一般程序凝胶电泳的一般程序制胶制胶点样点样电泳电泳染色染色观察观察二、二、DNA电泳电泳1.DNA分子种类分子种类1)线线状状DNA单单链链与与双双链链,ss-DNA电电泳泳时时要要注注意意局局部部区区域域形形成成ds-DNA,造成迁移距离不确定,造成迁移距离不确定2)环状环状DNA单链(如单链(如M13mp)和双链(质粒)和双链(质粒DNA)3)线状线状ds-DNA电泳电泳使用频率最高的一种电泳使用频率最高的一种电泳第二十页,共三十八页。这类这类DNA分子在电泳过程中迁移的距离受以下几个分子在电泳过程中迁
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