SC∕T 7216-2022 (代替 SC∕T 7216-2012)鱼类簿性神经坏死病诊断方法.pdf
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1、2022?11?11发布2023?03?01实施鱼类病毒性神经坏死病诊断方法50中华人民共和国水产行业标准备案号:XXXX-XXXX65.150CCS B72162022Diagnostic methods for viral nervous necrosis of fishSC中华人民共和国农业农村部发 布代替 SC/T?72162012S C/T 前言本文件按照G B/T 标准化工作导则第部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草.本文件代替S C/T 鱼类病毒性神经坏死病(VNN)诊断技术规程,与S C/T 相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下:a)增加了“术语和定义”一章
2、(见第章);b)增加了“临床症状”一章,描述了鱼类病毒性神经坏死病的典型症状(见第章);c)增加了“采样”一章,规范了采样对象、采样数量和采样部位(见第章);d)简化了对病理检查方法的描述(见第章,年版的第章);e)增加了一种病毒分离用的G F 细胞系(见 ),增加了病毒分离结果的判定方法(见 );f)删除了“免疫荧光”(见 年版的 )、“免疫组织化学”(见 年版的 )、“R T P C R方法”(见 年版的 );g)增加了“套式R T P C R检测”一章(见第 章);h)将“实时荧光R T P C R方法”更改为“R T q P C R检测”,提供了新的引物、探针、反应体系和反应程序,修改
3、了结果判定方法(见第 章,年版的 );i)将“结果综合判定”更改为“综合判定”,更改了疑似病例、确诊病例的判定方法,增加了病毒携带者的判定方法(见第 章,年版的第章);j)删除了“病毒性神经坏死病临床症状和病理变化”(见 年版的附录B),增加了“鱼类病毒性神经坏死病(VNN)”(见附录B);k)增加了鱼类病毒性神经坏死病组织病理特征示例(见附录C);l)增加了鱼类神经坏死病毒扩增产物的参考序列(见附录D).请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.本文件由农业农村部渔业渔政管理局提出.本文件由全国水产标准化技术委员会(S A C/T C )归口.本文件起草单位:
4、中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站、福建省淡水水产研究所、福建省水产技术推广总站.本文件主要起草人:史成银、万晓媛、樊海平、于秀娟、梁艳、吴斌、杨冰、刘莉、李清、林楠、李苗苗、张惠芬、王仁宝、于子健.本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为:年首次发布为S C/T ;本次为第一次修订.S C/T 鱼类病毒性神经坏死病诊断方法范围本文件界定了鱼类病毒性神经坏死病(v i r a ln e r v o u sn e c r o s i s,VNN)诊断的术语和定义,给出了缩略语、试剂和材料、仪器和设备,描述了临床症状,规定了采样要求,以及组织病理检查、病毒分离、套式R T P
5、C R检测、R T q P C R检测和综合判定的方法.本文件适用于鱼类病毒性神经坏死病的流行病学调查、诊断、检疫和监测.规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.S C/T 水生动物疾病术语与命名规则第部分:水生动物疾病术语S C/T 水生动物疾病术语与命名规则第部分:水生动物疾病命名规则S C/T 水生动物产地检疫采样技术规范术语和定义S C/T 和S C/T 界定的术语和定义适用于本文件.缩略语下列缩略语适用于本文件.AMV:禽成髓细
6、胞瘤病毒(a v i a nm y e l o b l a s t o s i sv i r u s)B F NNV:条斑星鲽神经坏死病毒(b a r f i nf l o u n d e rn e r v o u sn e c r o s i sv i r u s)B HQ:淬灭剂(b l a c kh o l eq u e n c h e r)C P E:细胞病变效应(c y t o p a t h i ce f f e c t)C q:定量循环(q u a n t i f i c a t i o nc y c l e)c D NA:互补D NA(c o m p l e m e n t a
7、 r yD NA)D E P C:焦碳酸二乙酯(d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e)D NA:脱氧核糖核酸(d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d)d NT P s:脱氧核糖核苷三磷酸混合物(d e o x y r i b o n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t em i x t u r e)E D T A:乙二胺四乙酸(e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d)E :从纹鳢细胞系(S S
8、N )中克隆得到的E 细胞系(E c e l l l i n e)F AM:羧基荧光素(c a r b o x y f l u o r e s c e i n)G F :石斑鱼鳍细胞系(g r o u p e r f i nc e l l l i n e,G F )NNV:神经坏死病毒(n e r v o u sn e c r o s i sv i r u s)P C R:聚合酶链式反应(p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n)q P C R:实时荧光P C R(q u a n t i t a t i v er e a l t i m eP C
9、R)R GNNV:赤点石斑鱼神经坏死病毒(r e d s p o t t e dg r o u p e rn e r v o u sn e c r o s i sv i r u s)R NA:核糖核酸(r i b o n u c l e i ca c i d)R T P C R:逆转录P C R(r e v e r s e t r a n s c r i p t i o nP C R)R T q P C R:实时荧光R T P C R(r e v e r s e t r a n s c r i p t i o nq u a n t i t a t i v er e a l t i m eP C
10、 R)S J NNV:黄带拟鲹神经坏死病毒(s t r i p e d j a c kn e r v o u sn e c r o s i sv i r u s)S C/T S S N :纹鳢细胞系(s t r i p e ds n a k e h e a df i s hc e l l l i n e,S S N )T a q:水生栖热菌(T h e r m u sa q u a t i c u s)T P NNV:红鳍东方鲀神经坏死病毒(t i g e rp u f f e rn e r v o u sn e c r o s i sv i r u s)VNN:病毒性神经坏死病(v i r
11、a ln e r v o u sn e c r o s i s)试剂和材料 水:蒸馏水、去离子水或相当纯度的水;R NA提取和c D NA合成应使用D E P C处理水.乙醇:按附录A中A 配制.乙醇:按A 配制.异丙醇:分析纯.水饱和酚.氯仿/异戊醇:氯仿与异戊醇的体积比为.D a v i d s o n sA F A固定液:按A 配制.苏木精染色液:按A 配制.伊红染色液:按A 配制.细胞系:S S N 、E 或G F .细胞培养液:按A 配制,或使用其他等效商品化试剂.鱼类神经坏死病毒参考株:由动物防疫主管部门指定单位提供.R NA提取变性液:按A 配制,或使用其他等效商品化试剂.乙酸钠
12、缓冲液:按A 配制.AMV逆转录酶、T a qD NA聚合酶:保存.逆转录酶缓冲液、T a qD NA聚合酶缓冲液:保存.R NA酶抑制剂:保存.d NT P s:含d AT P、d T T P、d C T P、d G T P各 mm o l/L的混合物,保存.琼脂糖:电泳级.T B E电泳缓冲液:按A 配制.电泳核酸染料:溴化乙锭或其他等效试剂.随机引物:保存.套式R T P C R引物:用于扩增NNV的衣壳蛋白基因片段.引物NNV 和引物NNV 是第一轮P C R引物,目的产物大小约 b p;引物NNV 和引物NNV 是第二轮P C R引物,目的产物大小约 b p.序列如下:a)引物NNV
13、:A C A C T G GAG T T T GAA AT T C A ;b)引物NNV:G T C T T G T T G AAG T T G T C C C A ;c)引物NNV:AT T G T G C C C C G C AAA C A C ;d)引物NNV:GA C A C G T T G A C C A C A T C A G T .R T q P C R引物和探针:用于检测NNV的衣壳蛋白基因片段,为简并引物和探针.序列如下:a)引物R NA F OR:C AA C T G A C A R C G AHC A C A C ;b)引物R NA R E V:C C C A C C A
14、YT T G G C VA C ;c)探针R NA p r o b e:F AM T Y C AR G C R A C T C G T G G T G C VG BHQ .仪器和设备 光学显微镜.S C/T 组织研磨器.高速冷冻离心机.生化培养箱.倒置相差显微镜.紫外分光光度计.P C R仪.水平电泳仪.凝胶成像仪.荧光定量P C R仪.临床症状病鱼食欲下降或厌食.行为不协调,多表现为螺旋式、涡旋状、向前窜动等异常游泳行为,或腹部朝上静止,或沉入水底.不同种类的鱼临床表现存在差异,如石斑鱼病鱼常表现为体色变黑,鳃盖张开,头部出血,鱼体出现畸形,或因鳔肿胀导致腹部膨大;鲆鲽鳎类病鱼会滞留在池塘底
15、部,身体蜷曲,头和尾向上翘.采样 对象鱼类病毒性神经坏死病的易感宿主应符合附录B的规定.数量应符合S C/T 中的规定.器官或组织体长c m的鱼,取整条鱼.体长c mc m的鱼,取包括脑和眼在内的整个头部.体长c m的鱼,采集脑和眼.对于只能用非致死性方式取样的亲鱼,可采集卵、性腺、卵巢液、精液和血液.组织病理检查 样品处理和观察活体解剖取脑和眼.迅速将组织切成厚度不超过mm的组织块,用D a v i d s o n sA F A固定液(按A 配制)固定h以上.根据组织块大小,固定时间宜适当调整或放置过夜.固定后,将样品转移至 乙醇中保存.对固定后的样品进行脱水、石蜡包埋、切片,用苏木精染色液
16、、伊红染色液依次染色、封片,置于光学显微镜下观察组织病理变化.卵、性腺、卵巢液、精液、血液等样品不宜用作组织病理检查.鱼类病毒性神经坏死病组织病理特征示例见附录C.结果判定样品视网膜和脑组织若呈现明显的空泡化或坏死病变,判定为具有典型的病毒性神经坏死病组织病理特征.病毒分离 样品处理NNV的分离,无症状的鱼最多 尾为个样品,有症状的鱼每尾为个样品.先用组织研磨器将样品匀浆成糊状,再按 的最终稀释度将其重悬于含有 I U/mL青霉素和 g/mL链霉素的细胞培养液(按A 配制)中,于 孵育hh或孵育h h.g离心 m i n,收集上清液.病毒接种与观察S C/T 在块 孔细胞培养板上传代培养S S
17、 N 、E 或G F 细胞约 h,形成单层细胞.用细胞培养液对 的组织匀浆上清液再做次 倍稀释,然后将、和 三个稀释度的上清液分别接种到上述块细胞培养板中.每个稀释度每块板至少接种孔,每孔接种 L.同时设置孔阳性对照(接种鱼类神经坏死病毒参考株)和孔空白对照(未接种病毒的细胞).将上述块细胞培养板分别置于()和()生化培养箱中培养.S S N 和E 细胞最适的培养温度为.G F 细胞分离NNV时最适的培养温度为.每天用倒置相差显微镜观察细胞病变效应(C P E)是否出现,连续观察 d.如果 d内接种组织匀浆上清液的细胞培养物出现了C P E,应对其进行套式R T P C R检测(见第 章)或R
18、 T q P C R检测(见第 章).S S N 或E 的C P E特征为细胞变薄或变圆,有折光,呈颗粒状的细胞内有空泡,单层细胞部分或全部崩解.G F 的C P E特征为起初局部区域的培养细胞变圆,呈颗粒状、折光性增强,然后病变扩散到整个细胞单层,最后细胞变性并脱落.如果 d内接种组织匀浆上清液的细胞培养物未出现C P E,需盲传一次.盲传时,将接种组织匀浆上清液的细胞培养物冻融一次后收集,g离心 m i n,收集上清液.取上清液 L接种到同种长满单层新鲜细胞的细胞培养板中,再培养观察 d.盲传培养期间出现C P E,或者盲传培养 d后仍未出现C P E,均应取细胞培养物进行套式R T P
19、C R检测(见第 章)或R T q P C R检测(见第 章).结果判定 空白对照孔细胞形态正常,且阳性对照孔细胞出现C P E,实验有效,否则实验无效,应重新进行实验.首次接种细胞或盲传细胞出现典型C P E,判定样品的病毒分离培养结果为阳性.首次接种细胞和盲传细胞均未出现典型C P E,判定样品的病毒分离培养结果为阴性.套式R T P C R检测 R N A提取 样品处理对于细胞培养样品,弃去细胞培养液,取 L细胞培养物,置于 mL离心管中,加入 LR NA提取变性液(按A 配制),然后用移液器抽吸次 次.对于组织样品,取鱼脑和眼组织,用组织研磨器匀浆成糊状,然后取 m g m g组织匀浆
20、液,置于 mL离心管中,加入 LR NA提取变性液,混匀.R N A抽提每管加入 L乙酸钠缓冲液(按A 配制),混匀;加入 L水饱和酚,混匀;再加入 L氯仿/异戊醇(体积比为),混匀后静置 m i n;g离心 m i n.取上层水相置于新的 m L离心管中,加入等体积的 预冷的异丙醇,上下颠倒数次使管中液体混匀,静置 m i n沉淀R NA;g离心 m i n.弃上清液,用mL 乙醇轻轻洗涤沉淀,室温静置 m i n m i n;g离心m i n.弃上清液,室温干燥沉淀m i n.加入 L LD E P C处理水溶解沉淀,即为样品R NA.提取的样品R NA可立即用于c D NA合成,或保存于
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