SC∕T 7242-2022 罗氏沼虾白尾病诊断方法.pdf
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1、2022?11?11发布2023?03?01实施罗氏沼虾白尾病诊断方法50中华人民共和国水产行业标准备案号:XXXX-XXXX65.150CCS B72422022Diagnostic methods for white tail disease of Macrobrachium rosenbergiiSC中华人民共和国农业农村部发 布S C/T 前言本文件按照G B/T 标准化工作导则第部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.本文件由农业农村部渔业渔政管理局提出.本文件由全国水产标准化技术委员会(S A C/T
2、C )归口.本文件起草单位:浙江省淡水水产研究所.本文件主要起草人:潘晓艺、沈锦玉、蔺凌云、姚嘉赟、袁雪梅、林锋、黄雷、尹文林.S C/T 罗氏沼虾白尾病诊断方法范围本文件界定了罗氏沼虾白尾病(w h i t et a i ld i s e a s e,WT D)诊断的术语和定义,给出了缩略语、试剂和材料、仪器和设备,描述了临床症状,规定了采样要求,以及组织病理检查、R NA提取、套式R T P C R检测、R T q P C R检测和综合判定的方法.本文件适用于罗氏沼虾白尾病的流行病学调查、诊断、检疫和监测.规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,
3、注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.G B/T 白斑综合征(WS D)诊断规程第部分:组织病理学诊断法S C/T 水生动物疾病术语与命名规则第部分:水生动物疾病术语S C/T 水生动物疾病术语与命名规则第部分:水生动物疾病命名规则S C/T 水生动物产地检疫采样技术规范术语和定义S C/T 和S C/T 界定的以及下列术语和定义适用于本文件.罗氏沼虾白尾病w h i t e t a i l d i s e a s e,WT D病原为罗氏沼虾野田村病毒,主要发生于罗氏沼虾仔虾淡化阶段,症状表现为第二或第三腹节处肌肉不透
4、明、坏死、分散的白浊斑点或不透明块,严重时全身肌肉呈乳白色.罗氏沼虾野田村病毒m a c r o b r a c h i u mr o s e n b e r g i in o d a v i r u s,M r N V罗氏沼虾白尾病的病原,属于野田村病毒科未定属,二十面体对称结构,无囊膜,直径约 n m,病毒基因组为双节段单链正链R N A,可感染罗氏沼虾幼体和仔虾,引起肌肉白浊、全身乳白色等症状,造成大量死亡.极小病毒 e x t r as m a l l v i r u s,X S VM r NV的卫星病毒,无独立感染能力,需在M r NV的帮助下进行复制,呈二十面体对称结构,无囊膜,直
5、径约 n m,病毒基因组为单链R NA,分类地位未定.缩略语下列缩略语适用于本文件.B HQ:淬灭剂(b l a c kh o l eq u e n c h e r)b p:碱基对(b a s ep a i r)C q:定量循环(q u a n t i f i c a t i o nc y c l e)D NA:脱氧核糖核酸(d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d)d NT P s:脱氧核糖核苷三磷酸混合物(d e o x y r i b o n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t em i x t u r e)
6、F AM:羧基荧光素(c a r b o x y f l u o r e s c e i n)M ML V:莫洛尼鼠白血病病毒(M o l o n e ym u r i n e l e u k e m i av i r u s)P C R:聚合酶链式反应(p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n)R T P C R:逆转录P C R(r e v e r s e t r a n s c r i p t i o nP C R)S C/T R T q P C R:实时荧光R T P C R(r e v e r s e t r a n s c r i p
7、t i o nq u a n t i t a t i v er e a l t i m eP C R)T a q:水生栖热菌(T h e r m u sa q u a t i c u s)试剂和材料 水:蒸馏水、去离子水或相当纯度的水;R NA提取和c D NA合成应使用D E P C处理的水.T R I z o lTM试剂:商品化试剂,保存.d NT P s(各 mm o l/L):商品化试剂,保存.d NT P s(各 mm o l/L):商品化试剂,保存.M ML V逆转录酶缓冲液:商品化试剂,保存.M ML V逆转录酶(U/L):商品化试剂,保存.R NA酶抑制剂(U/L):商品化试剂
8、,保存.P C R缓冲液(无M g):商品化试剂,保存.M g C l(mm o l/L):商品化试剂,保存.T a qD NA聚合酶(U/L):商品化试剂,保存.琼脂糖:电泳级.核酸染料:商品化试剂,保存.D NA M a k e r:商品化试剂,保存.H o t S t a r tT a qD NA聚合酶(U/L):商品化试剂,保存.M r NV套 式P C R引 物:引 物 浓 度 为 m o l/L,保 存.第 一 轮P C R引 物 分 别 是M r NV F 和M r NV R,扩增M r NV衣壳蛋白基因中的 b p片段(见附录A中的A );第二轮P C R引物分别是M r NV
9、 F 和M r NV R,从该片段中再扩增 b p的片段.引物序列如下:a)M r NV F:G C G T TA TAG AT G G C A C AA G G ;b)M r NV R:AG C T G T GAA AYT T C C A C T G G ;c)M r NV F:GAT GA C C C Y AA C G T T AT C C T ;d)M r NV R:G T G TAG TMA C T T G C A AGA G G .X S V套式P C R引物:引物浓度为 m o l/L,保存.第一轮P C R引物分别是X S V F 和X S V R,扩增X S V衣壳蛋白基因中的
10、 b p片段(见A );第二轮P C R引物分别是X S V F 和X S V R,从该片段中再扩增 b p的片段.引物序列如下:a)X S V F:T C T AG C T G C T GA C G T TAA AT G C ;b)X S V R:G GA G T C C C A ATA T G T TA C C AA AG ;c)X S V F:A C A T T G R C G G T T G G G T C A TA ;d)X S V R:G T G C C T G T T G C T GAA ATA C C .M r NV荧光定量P C R引物:引物浓度为 m o l/L,保存.扩增
11、引物分别是M r NV T q F和M r NV T q R,扩增M r NVR NA 中的 b p片段(见A );探针M r NV T q MAN.引物、探针序列如下:a)M r NV T q F:GA C C C A AAA G TA G C G AAG GA ;b)M r NV T q R:G G C YT C T C C C T T TAG T G T T ;c)M r NV T q MAN:F AM AAG C AA C C G C C T T C A AT G C C BHQ .X S V荧光定量P C R引物:引物浓度为 m o l/L,保存.其中,扩增引物分别是X S V T
12、q F和X S V T q R,扩增X S V衣壳蛋白基因中的 b p片段(见A );探针X S V T q MAN.引物、探针序列如下:a)X S V T q F:T C A TAG AG C C G C AGY AG G TA ;b)X S V T q R:C C A AR G C A C GAA C C A C T G GA ;S C/T c)X S V T q MAN:F AM A C G G TA T T T C AG C AA C AG G C A C A C T C A BHQ .阳性对照为确定感染M r NV和X S V的罗氏沼虾组织样品,保存.阴性对照为确定未感染M r NV
13、和X S V的罗氏沼虾组织样品,保存.空白对照为水.仪器和设备 P C R仪.荧光定量P C R仪.水平电泳仪.紫外观察仪或凝胶成像仪.高速冷冻离心机.水浴锅或金属浴.普通冰箱.超低温冰箱.电炉或微波炉.微量移液器.临床症状虾体不透明,尾部肌肉出现白浊现象,尤其在腹部.发病初期,第二或第三腹节出现肌肉白浊现象,并逐渐向前后扩散.严重时,尾部肌肉整体发白.初次出现症状后,第d死亡率达到高峰.特征见附录B.采样 对象幼体、仔虾、稚虾和成虾,优先采集淡化后的仔虾.数量应符合S C/T 的规定.器官或组织幼体与仔虾取整虾;稚虾和成虾宜取鳃、心脏、腹肌、尾肌、附肢或血淋巴.避免取眼球、眼柄和肝胰腺等组织
14、.非致死性方式取样的亲虾,可采集游泳足或鳃片.组织病理检查 样品处理和观察活体取样,迅速将整虾或切成厚度不超过mm的组织块,按G B/T 的方法进行组织固定、脱水、石蜡包埋、切片、苏木精染色和伊红染色、封片,并置于光学显微镜下观察.结果判定头胸部、腹部和尾部的横纹肌呈现急性玻璃样坏死、横纹透明变性、肌原纤维坏死和横纹溶解,肌细胞间的中度水肿和异常开放空间,以及肌细胞中出现大的椭圆形或不规则嗜碱性细胞质包涵体.组织病理特征见附录B.同时出现肌肉病变和细胞质包涵体,判定为具有典型的罗氏沼虾白尾病组织病理特征.R N A提取取样品 m g m g置于 mL无R NA酶离心管中,加入mLT R I z
15、 o lTM试剂,充分研磨后,室温m i n,加入 mL氯仿,振荡混匀 s,室温m i n.于下 r/m i n离心 m i n,取上层水S C/T 相,移至新离心管中.加入 mL预冷的异丙醇,混匀,室温 m i n.于 下 r/m i n离心 m i n,弃上清液.加入mL预冷的无R NA酶 乙醇,振摇m i n,再于 下 r/m i n离心m i n,弃上清液,室温晾干沉淀.加入 L LD E P C处理的水溶解,测定R NA质量和浓度后,立即用于R T P C R或保存于 备用.同时设置阳性对照、阴性对照和空白对照.也可采用等效的商品化R NA提取试剂或R NA提取试剂盒.套式R T P
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