第五章分子生物学研究方法.ppt
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1、第五章第五章分子生物学研究方法分子生物学研究方法5.1重组重组DNA技术发展史技术发展史5.2DNA操作技术操作技术5.3基因克隆技术基因克隆技术5.4基因表达研究技术基因表达研究技术5.5蛋白质组学及研究技术蛋白质组学及研究技术.5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史技术发展史4040年代明确了遗传的物质基础是年代明确了遗传的物质基础是DNA DNA 5050年代揭示了年代揭示了DNA DNA 分子的双螺旋结构模型和半分子的双螺旋结构模型和半保留复制,解决了基因的自我复制和遗传信息保留复制,解决了基因的自我复制和遗传信息传递问题传递问题 。5050年代末和年代末和6060年代提出了年
2、代提出了“中心法则中心法则”和操纵和操纵子学说,并成功地破译了遗传密码,从而阐明子学说,并成功地破译了遗传密码,从而阐明了遗传信息的流向和表达问题。了遗传信息的流向和表达问题。5.1.1重组重组DNADNA技术诞生的理论基础技术诞生的理论基础.5.1.25.1.2关键性实验技术问世为重组关键性实验技术问世为重组DNADNA技术奠基技术奠基 1 1、DNADNA分子的切割与连接技术分子的切割与连接技术限制性核酸内切酶和连接酶的陆续发现,才使分子生物学家有了进行DNA操作的基本工具。2 2、载体构建和大肠杆菌转化体系的建立、载体构建和大肠杆菌转化体系的建立 1970年M.Mandel和A.Hige
3、发现,大肠杆菌的细胞经过氯化钙适当处理之后,便能吸收噬菌体的DNA。1972年美国斯坦福大学S.Cohen报道,经氯化钙处理的大肠杆菌细胞也能摄取质粒DNA。大肠杆菌转化体系的建立,对重组DNA技术的创立具有特别重要的意义。3 3、SouthernSouthern杂交、杂交、DNADNA序列分析和聚合酶链反应序列分析和聚合酶链反应 5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史技术发展史.重组重组DNADNA技术技术(recombinant DNA technique):recombinant DNA technique):是是按照人们意愿,在体外对按照人们意愿,在体外对DNADNA分子进行重
4、组分子进行重组,再将再将重组分子导入受体细胞,使其在细胞中扩增和繁重组分子导入受体细胞,使其在细胞中扩增和繁殖,以获得该殖,以获得该DNADNA的大量拷贝的大量拷贝。基因克隆基因克隆(gene cloning)gene cloning)分子克隆分子克隆(molecular cloning)molecular cloning)5.1.35.1.3重组重组DNADNA技术的概念技术的概念5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史技术发展史.5.1.4 5.1.4 重组重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤 1 1、四大要素、四大要素 外源基因外源基因 载体载体 工具酶工具酶 受体细胞受体
5、细胞 5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史技术发展史.2 2、重组、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤 目的基因的获得与载体的制备目的基因的获得与载体的制备目的基因与载体目的基因与载体DNADNA的连接的连接重组重组DNADNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞重组体的筛选与重组重组体的筛选与重组DNADNA的鉴定的鉴定克隆基因的表达及表达产物的检测与分离纯化克隆基因的表达及表达产物的检测与分离纯化 5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史技术发展史.重组重组DNADNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因(外源基因)目的基因
6、(外源基因)基因组基因组DNAcDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNADNA目的基因目的基因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装,转染体外包装,转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史技术发展史.5.1.55.1.5重组重组DNADNA技术的意义技术的意义 重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟 重组DNA技术缩短了进化时间重组DNA技术使人能对生物进行定向改造体外大量扩增、研究其结构、功能及调控机制,从而拓宽了分子生物学的研究领域,
7、这对医学上各种疾病等病因的查明、诊断及治疗具有重大意义。5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史技术发展史.酶类酶类功能功能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开识别并在特定位点切开DNADNADNADNA连接酶连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个通过磷酸二酯键把两个或多个DNADNA片段连接成一个片段连接成一个DNADNA分子分子DNADNA聚合酶聚合酶按按55到到33方向加入新的核苷酸,补平方向加入新的核苷酸,补平DNADNA双链中双链中的缺口的缺口反转录酶反转录酶按照按照RNARNA分子中的碱基序列,根据碱基互补原则合分子中的碱基序列,根据碱基互补原则合成成DNADNA链
8、链多核苷酸激酶多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5-OH5-OH末端末端末端转移酶末端转移酶在双链核酸的在双链核酸的33末端加上多聚单核苷酸末端加上多聚单核苷酸DNADNA外切酶外切酶从从DNADNA链的链的33末端逐个切除单核苷酸末端逐个切除单核苷酸噬菌体噬菌体DNADNA外切酶外切酶从从DNADNA链的链的55末端逐个切除单核苷酸末端逐个切除单核苷酸碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶切除位于切除位于DNADNA链链55或或33末端的磷酸基团末端的磷酸基团5.1.65.1.6重组重组DNADNA实验中常见的主要工具酶实验中常见的主要工具酶5.1 5.1 重组重组DNA
9、DNA技术发展史技术发展史.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam H限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,RE)(restriction endonuclease,RE)一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶 分类分类:、(基因工程技术中常用(基因工程技术中常用型)型)5.15.1、重组重组DNADNA技术发展史技术发展史.第一个字母取自产生该酶的细菌属名,用大写;第一个字母取自产生该酶的细菌属名,用大写;第二、第三个字母是该细菌的种名,用小写;第二、第三个字母是该细菌的种名,
10、用小写;第四个字母代表株;第四个字母代表株;用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名命名Hin d属属系系株株序序Haemophilusinfluenzaed株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史技术发展史.类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome)即反相重复结构,是 DNA分子中以某一处为轴,其两侧核苷酸排列呈回文对称的序列。切口切口 :平端切口平端切口、粘端切口粘端切口GGGGA AT TCCCCCCCCT TA AGGGG5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史技术
11、发展史.Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口平端切口粘端切口粘端切口5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史技术发展史.DNADNA连接酶连接酶:通过磷酸二酯键把两个或多个通过磷酸二酯键把两个或多个DNADNA片片断连接成一个整体断连接成一个整体DNADNA分子。分子。T T4 4DNADNA连接酶连接酶EcoREcoR I I 连接酶连接酶T T7 7DNADNA连接酶连接酶5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史技术发展史.目的基因的来源目的基因的来源n原核细胞n真核细胞:cDNA或gD
12、NA文库n人工合成及PCR扩增目的基因 天然DNA(染色体DNA、病毒DNA(噬菌体DNA)、质粒DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA)5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史技术发展史.(八)重组实验中的主要载体(八)重组实验中的主要载体定义:定义:为携带目的基因,实现其无性繁殖为携带目的基因,实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNADNA分分子。子。5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史技术发展史.克隆载体克隆载体(cloning vector)(cloning vector)为为使使插插入入的的外外源源DNADNA序序列列被被扩扩增
13、增而而特特意意设设计的载体称为克隆载体。计的载体称为克隆载体。表达载体表达载体(expression vector)(expression vector)为为使使插插入入的的外外源源DNADNA序序列列可可转转录录翻翻译译成成多多肽链而特意设计的载体称为表达载体。肽链而特意设计的载体称为表达载体。5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史技术发展史.载体的选择标准载体的选择标准能自主复制能自主复制;具有两个以上的具有两个以上的遗传标记遗传标记物,便于重组体的筛选和物,便于重组体的筛选和鉴定;鉴定;有克隆位点有克隆位点(外源(外源DNADNA插入点),常具有多个单一插入点),常具有多个单一酶
14、切位点,称为多克隆位点;酶切位点,称为多克隆位点;分子量小分子量小,以容纳较大的外源以容纳较大的外源DNADNA。5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史技术发展史.n噬菌体载体:噬菌体载体:双链DNA病毒,约50kb,两端有一个12个核苷酸5端突出粘性末端 噬菌体噬菌体黏粒、黏粒、YACYAC、BAC BAC:高容量载体高容量载体5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史技术发展史.个克隆载体所容纳的外原个克隆载体所容纳的外原DNA片段的大小片段的大小n质粒:质粒:10kbn噬菌体:噬菌体:23kbn黏粒:黏粒:45kbnBAC:350kbnYAC:1000kb5.1 5.1 重组
15、重组DNADNA技术发展史技术发展史.以以质质粒粒为为载载体体的的DNA克克隆隆过过程程5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史技术发展史.5.2.1细菌转化细菌转化5.2 常见的常见的DNA操作技术操作技术转化转化(transformation):P151P151感受态细胞(感受态细胞(Competent cells):受体细胞经过一些特殊方法(如:CaCl2等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生变化,能容许有外源DNA的载体分子通过,处于这种状态下的细胞称将异源DNA分子引入一细胞株系,使受体细胞获得新的遗传性状转导?转导?转染?转染?.常用的转化方法:n化学转化(CaCl2)法
16、n电击法5.2 常见的常见的DNA操作技术操作技术.化学转化原理:化学转化原理:在在0冷冻处理时,处于冷冻处理时,处于CaCl2低渗溶液中的大肠杆低渗溶液中的大肠杆菌细胞膨胀成球形。菌细胞膨胀成球形。DNA可吸附于其表面。在短暂的可吸附于其表面。在短暂的热冲击下,细胞吸收外源热冲击下,细胞吸收外源DNA,然后在丰富培养基内,然后在丰富培养基内复原并增殖,表达外源基因。复原并增殖,表达外源基因。5.2 常见的常见的DNA操作技术操作技术.5.2 常见的常见的DNA操作技术操作技术.P1535.2 常见的常见的DNA操作技术操作技术.电击转化:电击转化:使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞,通过高
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