DBS22 026-2014 食品安全地方标准 食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定量检测.pdf
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1、 DBS22 吉林省地方标准 DBS22/0262014 食品安全地方标准 食品中单核细胞增生 李斯特氏菌的定量检测 2014-07-30 发布 2014-08-30 实施吉林省卫生和计划生育委员会 发 布 DBS22/0262014 1 吉林省食品安全地方标准 食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定量检测 1 范围 本标准规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的检验方法。本标准适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定量检验。2 定义和术语 2.1 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)单核细胞增生李斯特氏菌是李斯特氏菌属中唯
2、一引起人类致病菌的病原菌,亦可人畜共患。感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中,食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险,该菌在4 的环境中仍可生长繁殖,是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。3 设备和材料 除微生物实验室常规无菌及培养设备外,其他设备和材料如下:3.1 冰箱:2 5 和-15。3.2 恒温培养箱:30 1、36 1。3.3 均质器。3.4 显微镜:10 100。3.5 电子天平:感量 0.1 g。3.6 全自动微生物生化鉴定系统。3.7 锥形瓶:100 mL、500 mL。3.8 无菌吸管:1 mL(具 0.01 mL 刻度)、10 mL(具
3、0.1 mL 刻度)。3.9 无菌平皿:直径 90 mm。3.10 无菌试管:16 mm160 mm.。3.11 离心管:10 mL50 mL。3.12 无菌注射器:1 mL。3.13 L棒 4 培养基和试剂 4.1 含 0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE):见附录 A 中 A.1。4.2 含 0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE):见附录 A 中 A.2。4.3 李氏增菌肉汤 LB(LB1,LB2):见附录 A 中 A.3。DBS22/0262014 2 4.4 1%盐酸吖啶黄(acriflavine HCl)溶液:见附录 A 中 A.3.2.1。4.5 1%萘啶酮酸钠
4、盐(naladixic acid)溶液:见附录 A 中 A.3.2.1。4.6 PALCAM 琼脂:见附录 A 中 A.4。4.7 革兰氏染液:见附录 A 中 A.5。4.8 SIM 动力培养基:见附录 A 中 A.6。4.9 缓冲葡萄糖蛋白胨水甲基红(MR)和 V-P 试验用:见附录 A 中 A.7。4.10 5%-8%羊血琼脂:见附录 A 中 A.8。4.11 糖发酵管:见附录 A 中 A.9。4.12 过氧化氢酶试验:见附录 A 中 A.10。4.13 李斯特氏菌显色培养基。4.14 API listeria 10300 生化鉴定试剂盒。(由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一
5、信息是为了方便本标本的使用者,并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果,则可使用这些等效的产品。)4.15 金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)。4.16 马红球菌(Rhodococcus equi)。第一法第一法 单核细胞增生李斯特氏单核细胞增生李斯特氏菌菌平板计数法平板计数法 5 平板计数法实验原理 应用涂布法,单核细胞增生李斯特氏菌在选择鉴别培养基(如李斯特氏菌显色培养基或PALCAM琼脂)上显示可鉴别的特征性菌落,对确证为李斯特菌的菌落进行计数,并根据样液稀释倍数和接种样量换算每克样品的李斯特氏菌数。此方法适用与未经加工处理的生鲜食品或污染情况可能较重的水和食品。6 平
6、板计数法检验程序 单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法检验程序见图1。DBS22/0262014 3 10倍系列稀释检样25 g(mL)样品+225 m L PBS或生理盐水稀释液,均质选取2个3个适宜的连续稀释度的样品匀液,涂布李斯特氏菌显色培养基或PALCAM琼脂平板典型菌落计数及确证试验报 告36 1 24 h48 h10倍系列稀释检样25 g(mL)样品+225 m L PBS或生理盐水稀释液,均质选取2个3个适宜的连续稀释度的样品匀液,涂布李斯特氏菌显色培养基或PALCAM琼脂平板典型菌落计数及确证试验报 告36 1 24 h48 h 图 1 单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法检验程序 7
7、 操作步骤 7.1 样品保存 冷冻样品应在45以下不超过15 min或在2 5 不超过18 h解冻,若不能及时检验,应放于-15 左右保存;非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验,若不能及时检验,应置于2 5 冰箱保存,24 h内检验。7.2 样品处理 7.2.1 固态样品:无菌称取样品 25 g,放入盛有 225 mL PBS 或生理盐水的无菌均质杯内,用均质器以 8000 r/min10000 r/min 均质 1 min2 min,或放入盛有 225 mL PBS 或生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打 1 min2 min,制成 1:10 的样品匀液。7.2.2 液态样品:无菌吸取样
8、品 25 mL 至盛有 225 mL PBS 或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中,振荡混匀,制成 1:10 的样品匀液。DBS22/0262014 4 7.3 样品稀释 吸取上述 1:10 的样品匀液 1 mL 加到装有 9 mL PBS 或生理盐水的稀释管中,充分混匀制成 1:100 的样品匀液。据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1 次,换用 1 支 1mL 无菌吸管或吸头。7.4 样品接种与培养 根据对样品污染状况的估计,选择2个3个连续的适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),以0.3 mL、0.3 mL、0.4
9、mL 接种量分别加入三块李斯特显色平板或PALCAM琼脂平板,然后用无菌“L”棒涂布整个平板。使用前,如李斯特显色平板或PALCAM琼脂平板表面如有水珠,可放在25 50 的培养箱里干燥,直到平板表面的水珠消失。在通常情况下,涂布后,将平板静置10 min。如样液不易吸收,可将平板放在培养箱36 1 培养1 h,等样液吸收后翻转平皿,倒置于培养箱,361培养24 h2 h。如果菌落不典型,可继续培养至48 h2 h再观察。7.5 典型菌落观察 在科玛嘉李斯特氏菌显色培养基上,典型菌落为小的圆形蓝色菌落,周围有白色晕圈(其它品牌李斯特氏菌显色培养基上的菌落特征按照产品说明书判定)。在PALCAM
10、琼脂培养基上,典型菌落为小的圆形灰绿色菌落,周围有棕黑色水解圈,有些菌落有黑色凹陷。7.6 确证实验 7.6.1 初筛 自李斯特显色或PALCAM琼脂平板上分别挑取5个以上典型或可疑菌落,分别接种在木糖、鼠李糖发酵管于36 1 培养24 h;同时在含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE)平板上划线纯化,于30 1 培养24 h48 h。选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。7.6.2 鉴定 7.6.2.1 染色镜检:李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌。7.6.2.2 动力试验:用生理盐水制成菌悬液,在油镜或相差显微镜下观察,该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。SIM 半固体培养李斯特
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