DB21∕T 2396-2015 水稻品种抗稻瘟病基因检测 PCR法.pdf
《DB21∕T 2396-2015 水稻品种抗稻瘟病基因检测 PCR法.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《DB21∕T 2396-2015 水稻品种抗稻瘟病基因检测 PCR法.pdf(12页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、ICS 65.020.01 B 04 DB21 辽宁省地方标准 DB21/T 23962015 水稻品种抗稻瘟病基因检测 PCR 法 2015-05-18 发布 2015-07-18 实施 辽宁省质量技术监督局 发 布 DB21/T 23962015 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由辽宁省农业科学院提出。本标准由辽宁省农村经济委员会归口。本标准由辽宁省农业科学院创新中心负责起草。本标准主要起草人:陆晓春、郑文静、丛玲、赵家铭、王妍、张丽霞、白春明、王春语、朱振兴、马丽、李丹、王平、李金红等。本标准由辽宁省农业科学院创新中心负责解释。DB21/T 23
2、962015 1 水稻品种抗稻瘟病基因检测 PCR 法 1 范围 本标准规定了检测水稻品种抗稻瘟病基因的 PCR 检测法,包括原理、仪器设备、试剂和材料、防污染措施、实验步骤及结果分析。本标准适用于水稻品种中抗稻瘟病基因 pita、pid2、pid3、pik、pikp、pikm、piks、pi21、pi36、pi37和 pi5 的检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19495.2 转基因产
3、品检测 实验室技术要求 农业部 1485 号公告-42010 转基因植物及其产品成分检测 DNA 提取和纯化 3 术语及缩略语 下列术语及缩略语适用于本标准 3.1 正向引物:处于 DNA 双链上游的引物,简称 F 引物。3.2 反向引物:处于 DNA 双链下游的引物,简称 R 引物。3.3 内参引物:在聚合作用起始时,可以刺激合成另一种大分子,并与反应物以共价键形式连接的序列。3.4 DNA:Deoxyribonucleic acid,脱氧核糖核酸。3.5 PrimeSTAR HS DNA Polymerase:高保真 DNA 聚合酶。3.6 PrimeSTAR Buffer(5):5PCR
4、 反应液。3.7 dNTP Mixture(10mM):单核苷酸混合液(10mM)。3.8 PCR:Polymerase chain reaction。3.9 TAE:Tris-Cl、冰醋酸、EDTA 缓冲液。DB21/T 23962015 2 3.10 Goldenview:核酸染料,替代溴化乙锭。3.11 DNA Marker:标准分子量的核酸标记。3.12 bp:Base pair,碱基对。3.13 Tris:tris(hydroxymethyl)aminomethane,三羟甲基氨基甲烷。4 原理 根据水稻抗病基因保守区序列设计特异性引物,提取不同水稻品种的 DNA,对试样进行 PCR
5、 扩增,依据是否扩增获得预期大小的 DNA 片段及特定的序列来判断样品是否携带该抗病基因。5 仪器设备 5.1 台式离心机。5.2 PCR 仪。5.3 凝胶成像系统。5.4 琼脂糖电泳槽及电泳仪等电泳装置。5.5 恒温水浴锅。5.6 分析天平:感量 0.1g、0.01g 和 0.1mg。5.7 具盖塑料离心管:2mL,0.2mL。5.8 研钵、研杵。5.9 移液枪和吸头:1000 L,200 L,10 L。5.10 其它相关仪器设备 6 试剂和材料 6.1 供试水稻叶片或种子。6.2 DNA 提取试剂盒。6.3 PrimeSTAR HS DNA Polymerase。6.4 PrimeSTAR
6、 Buffer(5)。6.5 dNTP Mixture(10mM)。6.6 DNA Marker:可以清楚地区分 100bp1000bp 的 DNA 片段。6.7 50TAE 缓冲液,使用时稀释 50 倍。DB21/T 23962015 3 6.8 加样缓冲液。6.9 引物 见附录 A。除非另有说明,仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合 GB/T 6682 规定的一级水。7 防污染措施 检测过程中防止污染的措施按照GB/T19495.2中的规定执行。8 实验步骤 8.1 水稻 DNA 提取 按农业部 1485 号公告-42010 的规定执行。8.2 PCR 反应 8.2.1 将试样 DNA、Pri
7、meSTAR Buffer(5)、dNTP Mixture、正向引物及反向引物及 ddH2O 置于冰上融化。8.2.2 在 0.2mL 加盖无菌离心管中,按先后顺序加入:PrimeSTAR Buffer(5)6 L dNTP Mixture(2.5 mM)2.4 L 正向引物及反向引物(100nM)0.2 L(终浓度:0.2M0.3M),试样 DNA 1 L(20100ng)ddH2O 20.1 L PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/L)0.3 L 用移液枪抽打混匀,盖上盖子短暂离心,置于冰上待用。8.2.3 将离心管置于 PCR 仪中,反应程序为:95 预变性
8、 5 min,95 变性 30 s,55 61 退火 30 s,72延伸 30 s 60 s(每对引物的退火温度及延伸时间参见附录 A),29 个循环,72 总延伸 5 min,4 保存。8.3 PCR 产物电泳 8.3.1 用 200 mL 玻璃烧杯称取琼脂糖 0.5 g,加入 1TAE 缓冲液 50 mL。8.3.2 杯口用锡箔纸盖好,置微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。8.3.3 琼脂糖冷却至 50 左右时加入 2.5 L Goldenview,混匀,迅速将胶倒至模具中,放置上样梳。8.3.4 待胶完全凝固后,拔下上样梳,置于盛有 1TAE 缓冲液的电泳槽中。8.3.5 吸取 5 L PCR
9、 反应液,与 1L 加样缓冲液混匀,上样,130v 电泳 0.5 h1.0 h。8.3.6 电泳结束后,取下琼脂糖胶,利用凝胶成像系统观察电泳条带大小,并照相。8.4 PCR 产物测序 DB21/T 23962015 4 将 25L 的 PCR 产物提交至 DNA 测序技术机构,测序。9 结果分析 9.1 判定原则 9.1.1 模板质量的检测 所有参试品种的DNA,需用水稻内参引物(Primer9)检测,以确定DNA模板的浓度及纯度适宜,如用水稻内参引物(Primer9)扩增时无特异性PCR产物,则需重新提取试样DNA。9.1.2 结果判定原则 鉴定水稻品种中是否携带抗稻瘟病基因时,如不能扩增
10、出特定长度的 PCR 产物,则可判断试样中不含有相应的抗病基因;如可扩增出特定长度的 PCR 产物,则需结合电泳结果和测序结果共同分析。9.2 Pita 9.2.1 电泳结果分析 用附录 A 中 Primer1 扩增,如该品种携带 Pita 抗病基因,则其 PCR 产物应为 467bp,电泳图中其产物片段应处于 DNA Marker 的 400 bp500bp 间;反之,如无 PCR 产物或 PCR 片段长度与 467bp 差距较大则认为参试品种不携带 Pita 抗病基因。9.2.2 测序结果分析 PCR 产物的序列与附录 B 所示序列 seq-1 分析在 431 bp433 bp 处,如碱基
11、序列为 GCT 则该品种所含抗病基因则为 Pita 的抗病等位基因;反之,如该品种在 431 bp433 bp 处测得的序列为 TCT 或其它序列,则认为参试品种含有 Pita 的感病等位基因。9.3 Pid2 9.3.1 电泳结果分析 用附录 A 中 Primer2 扩增,如该品种携带 Pid2 抗病基因,则其 PCR 产物应为 496bp,电泳图中其产物片段应处于 DNA Marker500bp 左右;反之,如无 PCR 产物或产物片段长度与 496bp 差距较大则认为参试品种不携带 Pid2 抗病基因。9.3.2 测序结果分析 PCR 产物的序列与附录 B 所示序列 seq-2 分析在
12、263 bp265 bp 处,如碱基序列为 ATA 则该品种所含抗病基因则为 Pid2 的抗病等位基因;反之,如为 ATG 或其它序列,则认为参试品种含有 Pid2 的感病等位基因。9.4 Pid3 9.4.1 电泳结果分析 用附录 A 中 Primer3 扩增,如该品种携带 Pid3 抗病基因,则其 PCR 产物应为 550bp,电泳图中其产物片段应处于 DNA Marker 500bp600bp 间;反之,如无 PCR 产物或产物片段长度与 550bp 差距较大则认为参试品种不携带 Pid3 抗病基因。DB21/T 23962015 5 9.4.2 测序结果分析 PCR 产物的序列与附录
13、B 所示序列 seq-3 分析在 232 bp234 bp 处,如碱基序列为 CAG 则该品种所含抗病基因为 Pid3 的抗病等位基因;反之,如为 TAG 或其它序列,则认为参试品种含有 Pid3 的感病等位基因。9.5 Pik/Pikp/Pikm/Piks 9.5.1 电泳结果分析 用 Primer4 扩增,如该品种携带 Pik/Pikp/Pikm/Piks 抗病基因,则其 PCR 产物应为 992bp,电泳图中其产物片段应处于 DNA Marker 1000bp 左右;反之,如无 PCR 产物或产物片段长度与 1000bp 差距较大则认为参试品种不携带 Pik/Pikp/Pikm/Piks
14、 抗病基因。9.5.2 测序结果分析 PCR 产物的序列与附录 B 所示序列 seq-4 比对,如在 685 bp687 bp 处碱基序列为 GAG 且在 754 bp756 bp 处为 CCT,则该品种所含抗病基因为则为 Piks 的抗病等位基因;如在 685 bp687 bp 处碱基序列为 CAG 且在 754 bp756 bp 处为 CCT,则该品种所含抗病基因为 Pikm 的抗病等位基因;如在 685 bp bp687 处碱基序列为 AAG 且在 754 bp756 bp 处为 CAT,则该品种所含抗病基因为 Pik 的抗病等位基因;如在 685 bp687 bp 处碱基序列为 AAG
15、 且在 754 bp756 bp 处为 GAT,则该品种所含抗病基因为 Pikp 的抗病等位基因;反之,待检品种在上述区域序列与几种等位基因均不符,则认为参试品种不含有 Pik 及其它几个抗病等位基因。9.6 Pi21 9.6.1 电泳结果分析 用 Primer5 扩增,如该品种携带 Pi21 抗病基因,则其 PCR 产物应为 633 bp,反之,如无 PCR 产物或产物片段长度与 633bp 差距较大则认为参试品种不携带 Pi21 抗病基因。9.6.2 测序结果分析 PCR 产 物 的 序 列 与 附 录 B 所 示 序 列 seq-5 比 对,如 在 138 后 及 在 321 后 分 别
16、 有ctgccgcagccgccgccgccg21 个及 tgcaagccggaggagccgccgaagccgccgccggagaagccgccgccg 及 48 个碱基的缺失(即去除前后引物结合的位置,参试品种序列应与 seq-5 所示序列一致),则该品种所含抗病基因为 Pi21的抗病等位基因;反之,若待检品种不存在上述特定序列的缺失,则认为参试品种不含有 Pi21 抗病基因。9.7 Pi36 9.7.1 电泳结果分析 用 Primer6 扩增,如该品种携带 Pi36 抗病基因,则其 PCR 产物应为 452 bp,电泳图中其产物片段应处于 DNA Marker 400 bp 500 bp
17、 间;反之,如无 PCR 产物或产物片段长度与 452bp 差距较大则认为参试品种不携带 Pi36 抗病基因。9.7.2 测序结果分析 PCR 产物的序列与附录 B 所示序列 seq-6 分析在 271 bp273 bp 处,如碱基序列为 AGT 则该品种所含抗病基因则为 Pi36 的抗病等位基因;反之,如为 AAT 或其它序列,则认为参试品种含有 Pi36 的DB21/T 23962015 6 感病等位基因。9.8 Pi37 9.8.1 电泳结果分析 用 Primer7 扩增,如该品种携带 Pi37 抗病基因,则其 PCR 产物应为 600 bp,电泳图中其产物片段应处于 DNA Marke
18、r 600bp 附近;反之,如无 PCR 产物或产物片段长度与 600 bp 差距较大则认为参试品种不携带 Pi37 抗病基因。9.8.2 测序结果分析 PCR 产物的序列与附录 B 所示序列 seq-7 比对,如在 295 bp297 bp 处碱基序列为 GTA,且在 319 bp321bp 处碱基序列为 ATG,则该品种所含抗病基因则为 Pi37 的抗病等位基因;如在 295 bp297 bp处碱基序列为 GCA 或其它序列,以及在 319 bp321bp 处碱基序列为 ATC、ATA 或 ATT 或其它序列,则认为参试品种含有 Pi37 的感病等位基因。9.9 Pi5 用 Primer8
19、 扩增,如该品种携带 Pi5 抗病基因,则其 PCR 产物应为 1105 bp;反之,如无 PCR 产物或产物片段长度与 1105 bp 差距较大则认为参试品种不携带 Pi5 抗病基因。DB21/T 23962015 7 A A 附 录 A(规范性附录)用于扩增抗稻瘟病基因的引物 抗病基因 引物序列 (5-3)退火温度()延伸时间(s)F ACTTCATGTT TGTCTGTACA GCA Pita Primer1 R TCAAACAATC ATCAAGTCAG 55 30 F GAT ATGTAGGCAC TAACTTCTTC Pid2 Primer2 R CCAAGATACA CAGATC
20、CAAA CC 55 30 F CATGACAACC CTTCAGACAT Pid3 Primer3 R ACAGAGCAGG AACTTCAGAT 55 30 F GCAGAGTTCATCAGATCCGAGCT Pik/Pikp/Pikm/Piks Primer4 R GCTGATATGT TGTCGATGAG ATG 55 60 F AAGGTGGAGTACGACGTGAA Pi21 Primer5 R TCACATGATG GAGCAGGCGT T 55 60 F GTTCATGATA TGGTGCTCGA TC Pi36 Primer6 R TCCGGCAGCT CTTCTATTGT
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- DB21T 2396-2015 水稻品种抗稻瘟病基因检测 PCR法 DB21 2396 2015 水稻 品种 稻瘟病 基因 检测 PCR
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【tea****ft】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【tea****ft】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。