两种芦荟多糖的分析方法比较.doc
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4、成 绩: 指导教师(职称): 两种芦荟多糖分析方法的比较摘要:目的:通过比较两种芦荟多糖的分析方法,明确两种方法适合的范围。目前芦荟多糖的提取方法多数为水提醇沉淀法,但是对于水提醇沉法,又有多种分析芦荟多糖的方法。为寻找比较简单易行的芦荟多糖提取工艺,本文主要比较了两种常见的分析方法蒽酮硫酸法和苯酚硫酸法,对这两种方法中的仪器和材料、实验方法及过程复杂程度、效率这三个部分进行比较。通过比较得出,利用苯酚硫酸法分析多糖适合小型研究和实验室使用。而蒽酮硫酸法分析多糖用于工厂生产。关键词:芦荟多糖;分析方法;蒽酮硫酸分析法;苯酚硫酸分析法 自古以来,芦荟作为一种天然的药用植物在民间就得到广泛的应用1
5、。它被用于治疗便秘、烧伤、烫伤等多种疾病,同时具有安全、有效、易用等突出特点2。芦荟是属多年生肉质本草植物,具有生命力强、药用价值高等特点3。早在唐代,中国的本草拾遗就简略记载了芦荟的药用价值4。随着科学技术的发展,现代大量研究进一步证明芦荟具有抗菌消炎、抗溃疡、抗癌、促进伤口愈合、抗肿瘤、保健美容等作用5 。其性味苦,寒,入肝、心、脾经,可清热、通便、杀虫、治热结便秘、妇女闭经、癣疮等疾病6。芦荟中的化学成分复杂,目前已知的主要有蒽醌类化合物、蛋白质、矿物质、多糖等7。芦荟多糖是一大类分子化合物,一般是由葡萄糖以及葡萄糖聚合物组成,占芦荟的0.05%3%8。随着糖类生化技术和免疫学研究的发展
6、,人们对芦荟多糖有了越来越多的认识。 尽管芦荟药用价值很高,但是近年来的多数研究主要是集中在芦荟多糖的药效上,并没有深入而细致的开展关于其提取工艺的方法研究,我国芦荟产业的发展也受到一定的制约9。本实验是在一般芦荟多糖的水提醇沉淀法提取工艺的基础上,对芦荟多糖分离提纯后的分析方法蒽酮硫酸法和苯酚硫酸法这两种方法的探讨,比较两种方法的材料需要和效率,分析提取芦荟多糖的最佳的提取方法,进一步明确芦荟多糖分析方法蒽酮硫酸法和苯酚硫酸法实用的范围,区别和明确实验室和工厂生产适合的提取方法。1方法一:苯酚硫酸法1.2 材料与仪器“日历高冷却离心机(himacR22E);热重分析仪(STA 409C);旋
7、转蒸发仪(R-134);酸度计;榨汁机;7530紫外分光光度计;BS110S电子分析天平;1000r/min高速自控组织捣碎机。无水乙醇;浓硫酸;丙酮;去离子水;苯酚;乙醚;D-甘露糖;试剂均为分析纯。1.3 实验方法1.3.1 标准曲线绘制精密称取105干燥至恒重的甘露糖0.100g于100mL容量瓶中,加蒸馏水定容。用移液管精密移取5ml置于50mL容量瓶中,加蒸馏水定容。分别精密移取0mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL于50mL容量瓶中,加蒸馏水定容。然后分别精密吸取2ml于试管中,加1mL苯酚摇匀,加5mL浓硫酸迅速摇匀后,静置5分钟,后用沸水浴15分钟加热,冷却至室温,用分
8、光光度法于波长为490nm处测吸收光度。得出结果列表显示,以浓度为横坐标,吸收度为纵坐标绘制标准曲线,计算得出回归方程10。1.3.2 芦荟多糖的提取 采用水提醇沉法提取芦荟多糖苯酚硫酸法进行分析。取芦荟叶片洗净、去刺。在去离子水中浸泡,除去表皮渗出的黄色液汁。然后切去表皮,将内层凝胶至于离心水中浸洗,捣碎,纱布过滤,次日离心,抽滤,所得芦荟汁经浓缩后,再次离心,以除尽纤维质,冷藏备用。然后向芦荟凝胶浓缩汁加入无水乙醇,使其乙醇终浓度为80%,沉淀12h后,高速离心得多糖沉淀。取沉淀物溶于蒸馏水中配成溶液,过滤,摇匀,定容至250ml容量瓶中,既得芦荟多糖溶液。1.3.3 总糖含量测定 精密量
9、取芦荟粗多糖溶液5mL置于50mL容量瓶中,加蒸馏水溶解并稀释至刻度,从中精密吸取2mL置于试管中,照1.3.1项下自加苯酚起以此操作,测得吸收度依回归方程计算,再乘上稀释倍数,得芦荟多糖相对含量”11。1.3.4 精密度试验 平行取六份甘露糖和芦荟多糖溶液,苯酚-硫酸法显色后测定D值。1.3.5 回收实验加样回收率试验取芦荟多糖提取液5份,分别加入一定量的甘露糖标准液,进行回收试验。2 方法二:蒽酮硫酸法2.1 材料与仪器 芦荟凝胶冻干粉;乙醇;乙醚;蒽酮;葡萄糖;三氯乙酸;浓硫酸;试剂均为分析纯。超滤膜(截留分子量为3万和10万);722型分光光度计;LDZ4-08型自动平衡离心机;BS1
10、1OS电子分析天平。2.2 实验方法 2.2.1 芦荟凝胶冻干粉中总糖的测定 采用蒽酮-硫酸法测定,葡萄糖作为标准对照品。总糖由单糖、寡聚糖和多糖组成。寡聚糖和多糖在浓硫酸作用下,可经脱水反应生成糖醛或羟甲基糖醛,生成的糖醛或羟甲基糖醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糖醛衍生物12。在一定范围内,颜色的深浅与含糖量成正比,故可利用分光光度计测定其吸光度,并利用标准曲线计算出样品中总糖量5。2.2.3 葡萄糖标准溶液的配制准确称取无水葡萄糖0.010g加蒸馏水溶解,定容至10mL。得浓度为1.0mg/mL的葡萄糖溶液,用蒸馏水稀释10倍,配制成100g/mL的标准葡萄糖溶液。2.2.4 蒽酮试剂的配制 称
11、取2000g蒽酮,溶于80%浓硫酸1000mL中,冷却至室温,贮于具塞棕色瓶内,冰箱保存,可使用2到3周。2.2.5 标准曲线的测定分别取100g/ml的标准葡萄糖溶液0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL加入10mL离心管中,加蒸馏水定容至1mL,用移液管加入5mL蒽酮试剂,摇匀置沸水浴中煮15min,冰水冷却,空白管调零,1cm光径比色皿于分光光度计620nm处测定溶液吸光度A值。以A值为纵坐标,葡萄糖浓度C为横坐标,得出标准曲线。用A值和样品稀释倍数可以算出多糖浓度C,通过C和样品中凝胶粉的浓度计算出凝胶粉中多糖的含量X14。2.2.6 芦荟凝胶冻干粉中多糖的
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