基因转移技术.ppt
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1、基因转移技术生技30802龚凯概述l运用物理、化学或生物学的方法和技术将外源基因转移到受体细菌或者细胞内,并使之在细菌或细胞内实现转入基因的扩增好表达称为基因转移技术。它是重组DNA技术和基因治疗的关键步骤之一。两个概念两个概念l转化:质粒DNA或其他载体与目的基因DNA构建的重组载体导入宿主细胞的过程。l转染:噬菌体,病毒或以其他作为载体构建的重组载体导入宿主细胞的过程。基因转移技术的应用l外源基因与载体在体外重组形成重组DNA分子后,为了分析基因的表达,测定表达对细胞生长的影响,研究该基因的结构与功能,得到高表达的基因产物,通常需要将重组DNA分子通过特定的方法导入宿主细菌(细胞)。基因转
2、移技术的分类:l第一类是将目的基因转导入体外培养的细胞或导入从体内取出的细胞,观察目的基因在细胞中的表达,这项技术称基因转染(gene transfection)技术。通常情况下,该技术转入的目的基因不与细胞染色体发生整合,而是在细胞质呈现暂时性表达,随时间推移而逐渐减弱或消失。为了使目的基因进入细胞后能与细胞基因组DNA发生整合、产生永久性的表达,需用病毒载体将目的基因导入细胞,并发生整合;l第二类是将已克隆的目的基因导入受精卵,并将导入基因后的受精卵植入子宫,发育成胚胎和个体,胚胎期和出生后均可观察目的基因在整体内的表达,此项技术称转基因技术(transgenic technique),转
3、基因技术所产生的动物称转基因动物(transgenic animal)。1.基因转移的物理学方法2.基因转移的化学方法3.基因转移的生物学方法第一节、基因转移的物理学方法主要有:l1.显微注射法l2.电穿孔法l3.基因枪法一、显微注射法(Microinjection)l受体细胞主要是卵细胞,现在也用于贴壁细胞l成功率与操作者的熟练程度有关l主要用于转基因动物l显微注射技术是利用显微操作系统和显微注射技术将外源目的基因直接注入到受精卵的原核中,使外源基因整合到受体细胞的基因组内,再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体动物的子宫内发育,从而获得转基因动物。l它是目前基因转移效率较好的
4、一种基因转移方法,1.可直接用不含有原核载体DNA片段的外源基因进行转移;2.外源基因的长度不受限制,可达100kb;3.实验周期相对比较短。二、电穿孔法(Electroporation)l电穿孔电穿孔(electroporation)是指在高压电脉冲的作用下使细胞膜上出现微小的孔洞。从而导致不同细胞之间的原生质膜发生融合作用的细胞生物学过程。几乎所有类型的细胞,包括植物的原生质体、动物的初生细胞,以及不能用其它方法(诸如磷酸钙或DEAE-葡聚糖法)转染的细胞,都可以成功地使用电穿孔技术进行基因转移。此项技术具有操作简便,基因转移效率高等优点。(1)基本原理)基本原理l在高压电场的作用下,细胞
5、膜因发生临时性破裂所形成的微孔,足以使大分子以及像ATP这样的小分子从外界进入细胞内部,或是反向流出细胞。细胞膜上微孔的关闭是一种天然衰减的过程,在0下,这种过程会被延缓进行。在微孔开启期间,细胞外环境中的核酸分子便会穿孔而入,并最终进到细胞核内部。具有游离末端的线性DNA分子,易于发生重组,因而更容易整合到寄主染色体,形成永久性的转化子。超盘旋的DNA比较容易被包装进染色质,因此一般说来它对于瞬时基因表达的实验更为有效。(2)操作程序)操作程序l将盛有细胞和 DNA混合液的特制小容器置于电泳冲仪的正负电极之间,在 0 下加高压(2.04.0kV)电脉冲 10分钟后,将处理的细胞转移到新鲜培养
6、基中生长 2天,再行筛选。电穿孔之前若用秋水仙酞胺(colcemid)预处理细胞10小时,可提高转化效率310倍。(3)影响因素影响因素l脉冲的最大电压和脉冲持续的时间,是影响电穿孔转染效率的两个主要因素,而与DNA浓度则无多大关系。电穿孔转染效率主要取决于所用的细胞类型。对于不适合用传统方法转染的细胞,用电穿孔法得到的永久转化的频率约为10-410-5之间。l可用于真核、原核细胞的转染l优点:简单、重复性好、转移效率高l缺点:对细胞有损伤三、基因枪法(gene gun)该法又称粒子轰击(particle bombardment),高速粒子喷射技术(High-velocity particle
7、 microprojection)或基因枪轰击技术(gene gun bombardment),是由美国Comel大学生物化学系John.C.Santord等于1983年研究成功。在1987年,Vlein首先报道了应用此技术将TMV(烟草花叶病毒)RNA吸附到钨粒表面,轰击洋葱表皮细胞,经检测发现病毒RNA能进行复制,并以同样技术将CAT(Chloraphericol acetyltransferase氯霉素乙酰转移酶基因)基因导入洋葱表皮细胞。现在,该技术已在烟草、水稻、小麦、黑麦草、甘蔗、棉花、大豆、菜豆、洋葱、番木瓜、甜橙、葡萄等多种作物上成功。l基本原理:通过动力系统将带有基因的金属颗
8、粒(金粒或钨粒),将DNA吸附在表面,以一定的速度射进植物细胞,由于小颗粒穿透力强,故不需除去细胞壁和细胞膜而进入基因组,从而实现稳定转化的目的。l优点:具有应用面广,方法简单,转化时间短,转化频率高,实验费用低等优点。对于农杆菌不能感染的植物,采用该方法可打破载体法的局限。第二节、化学转染法l利用化学物质对细胞或DNA分子进行处理和修饰,以使外源性DNA顺利进入细胞内的方法。l包括:1.氯化钙转移法氯化钙转移法 2.DNA-磷酸钙共沉淀法磷酸钙共沉淀法 3.DEAE-葡聚糖转染技术 4.脂质体转染法脂质体转染法(liposome)1.氯化钙转移法l感受态细胞(competent cell):
9、理化方法诱导细胞,使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。l目前常见的感受态细胞的制备方法有CaCl2,RbCl2法,RbCl2发制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行。氯化钙转移法基本操作:基本操作:l1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温(0)预处理的低渗氯化钙溶液中,便会造成细胞膨胀,同时CaCl2会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构,促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来,离开所在区域,诱导细胞成为感受态细胞细胞膜通透性发生变化,极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基磷酸钙复合物。l2.此时,将该体系转移到42下做短暂的热刺激(90s),细胞膜
10、的液晶结构会发生剧烈扰动,并随机出现许多间隙,外源DNA就可能被细胞吸收。进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达,实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。l3.将转化后的细胞在选择性培养基上培养,筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。2.DNA-磷酸钙共沉淀法l核酸以磷酸钙-DNA 共沉淀物的形式出现时,可使DNA 附在细胞表面,利于细胞吞入摄取,或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内,进入细胞的DNA 仅有1%5%可以进入细胞核中,其中仅有不到1%的DNA 可以与细胞DNA 整合,在细胞中进行稳定表达,基因转导的频率大约为10-4,这项技术能用于任何DNA 导入哺乳类动物进行暂时性
11、表达或长期转化的研究。此方法对于贴壁细胞转染是最常用并首选的方法。l先将DNA分子溶解到氯化钙溶液中,再缓慢滴加含磷酸的HEPES溶液,形成细小的DNA-磷酸钙共沉淀颗粒。小心地将这些颗粒吸出加入到培养的靶细胞表面,保温数小时后,DNA会被靶细胞吞噬。更换培养基以使外源性基因在靶细胞中表达,再筛选转化阳性的细胞。l优点:方法简单,而且可以进行共转化,即将不含选择标记的DNA放在一起形成混合的共沉淀物,一起导入细胞。l缺点:转染效率低,约为10-3-10-6。影响影响DNA-磷酸钙共沉淀法效率的因素效率的因素l影响磷酸钙转染效率的主要因素有:1.DNA-磷酸钙共沉淀物中DNA的数量。2.共沉淀物
12、与细胞接触的保温时间。3.甘油或DMSO等促进因子作用的持续时 间等。3.DEAE-葡聚糖转染技术葡聚糖转染技术l二乙氨乙基葡聚糖二乙氨乙基葡聚糖(diethyl-aminoethyl-dextran),简称DEAE-葡聚糖,是一种高分子量的多聚阳离子试剂,能促进哺乳动物细胞捕获外源的DNA,实现瞬时的有效表达。l基因的瞬时表达基因的瞬时表达:是指在DNA进入细胞后迅速发生的反应,因此可作为一种有用的基因分析系统。DEAE-葡聚糖转染的细胞往往可以获得高水平的表达,利于基因瞬时表达(transient expression)实验。DEAE-葡聚糖转染主要有两种不同的方式葡聚糖转染主要有两种不同
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