实验二-SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量.ppt

,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,实验二,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳,（,SDS-PAGE,）测定蛋白质相对分子质量,2015.9.23,一、实验目的,二、实验原理,三、实验步骤,本节课的内容,一、实验目的,学习,SDS,-,聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理。,掌握,SDS,-,聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术。,什么是电泳？,电泳（,electrophoresis,）是指带电颗粒在电场中的泳动。许多重要的生物分子如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都含有可电离基团，在非等电点条件下带有电荷，在电场力的作用下，它们,向着与其所带电荷相反的电极移动,。电泳技术就是利用样品中各种分子带电性质、分子大小、形状等的差异，在电场中的迁移速度不同，从而对样品进行分离、纯化和鉴定的一种综合技术。可用于样品的制备、纯度鉴定、分子量测定等。,电泳的基本知识和原理,影响带电粒子在电场中泳动的因素,1,生物大分子的性质：,待分离生物大分子所带电荷的多少、分子大小和性质都会对电泳产生明显影响。,2,缓冲液：,缓冲液,pH,值直接影响生物大分子的解离程度和带电性质,.,溶液,pH,值距离等电点愈远，生物大分子所带净电荷就越多，电泳时速度就越快。,当缓冲液,pH,大于等电点时，生物大分子带负电荷，电泳时向正极移动；当缓冲液,pH,小于等电点时，生物大分子带正电荷，电泳时向负极移动。,电泳的基本知识和原理,3,电场强度：,电场强度指每单位介质长度的电位梯度（又称电位差或电位降）。,一般而言，电场强度越大，电泳速度越快。,但随着,电场强度的增大,会引起通过介质的电流强度增大，从而造成,电泳过程产生的热量增多,，最终导致介质温度升高。降低电流强度，可以减少产热，但会延长电泳时间，引起生物大分子扩散增加，同样影响分离效果。所以电泳实验中要选择适当的电场强度。,电泳的基本知识和原理,4,电渗：,液体在电场中对于固体支持介质的相对移动称为电渗。,由于支持介质表面存在一些带电基团，如滤纸表面含有羧基，琼脂含有硫酸基等。这些基团电离后使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的离子在电场作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动。,当电渗方向与电泳方向相同时则加快电泳速度；当电渗方向与电泳方向相反时，则降低电泳速度。,电泳的基本知识和原理,电泳技术的分类,1.,根据电泳中是否使用支持介质分为自由电泳和区带电泳：,自由电泳不使用支持介质，电泳在溶液中进行。区带电泳需使用支持介质，根据支持介质不同可分为醋酸纤维薄膜电泳、薄层电泳和,凝胶电泳,等。根据支持介质的装置形式不同又可分为水平板式电泳、垂直板式电泳、垂直盘状电泳、毛细管电脉等。,2.,根据电泳时电压的高低分为高压电泳和常压电泳：,高压电泳使用的电压在,500,1000V,，这类电泳分离速度快，但热效应较大，必须具备冷却装置，主要适用于小分子化合物的快速分离。常压电泳使用的电压在,500 V,以下，电位梯度为,2,10 V/cm,。这类电泳的分离速度较慢，但对电泳设备要求简单。,电泳的基本知识和原理,电泳示踪剂,电泳常用的示踪剂有,溴酚兰,和,二甲苯青,FF,。示踪剂一般与蔗糖、甘油组成上样缓冲液，蔗糖、甘油可增加溶液密度，使其比重增加，以确保样品均匀沉入加样孔内。,电泳的基本知识和原理,蛋白质变性,0.1-1%SDS,0.1 M beta-,巯基乙醇,蛋白质与SDS分子按比例结合,1,：,1.4,SDS,SDS,的性质与作用,SDS,的结构决定了它可破坏蛋白质的疏水作用（该作用对维持蛋白三级和四级结构相当重要），,SDS,：十二烷基磺酸钠，十二烷基部分是疏水结构，而磺酸钠部分是亲水或极性结构。,SDS,的疏水结构可插入蛋白质的疏水内部（通常水溶性的蛋白质，其疏水氨基酸残基埋藏在蛋白内部，亲水氨基酸残基位于分子表面），这样，,SDS,就破坏了蛋白的疏水作用，从而破坏蛋白的三级或四级结构，引起变性。,beta-,巯基乙醇,SDS-,蛋白质复合物,分子构型,也几乎相同,(,雪茄烟形的长椭圆棒状的复合物,),，而且具有相同的,荷质比,，因此在,SDS-PAGE,中，,SDS-,蛋白质复合物的电泳迁移率只与其分子量有关，而不再受所带电荷及分子形状的影响，且在一定条件下，,迁移率与分子量呈对数线性关系,SDS,的性质与作用,丙烯酰胺凝胶电泳：,以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳方法称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（,PAGE,）。聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，具有机械强度好、弹性大、透明、化学稳定性高、,无电渗作用,、设备简单、样品量小（,1,100 g,）、分辨率高等优点，并可通过控制单体浓度或与交联剂的比例聚合成不同大小孔径的凝胶。可用于蛋白质、核酸等分子大小不同的物质的分离、定性和定量分析；还可结合解离剂十二烷基硫酸钠（,SDS,）以测定蛋白质亚基的相对分子质量。,聚丙烯酰胺凝胶的性质,聚丙烯酰胺凝胶性质,聚丙烯酰胺凝胶,(PAG),是由丙烯酰胺（,Acr,）和甲叉双丙烯酰胺（,Bis,）在催化剂的作用下，聚合交联而成的。,聚丙烯酰胺凝胶的性质,聚丙烯酰胺凝胶的聚合体系有两种：,（,1,）化学聚合：,通常采用过硫酸铵,(AP),为催化剂，四甲基乙二胺（,TEMED,）为加速剂。在,TEMED,催化下，过硫酸铵可使丙烯酰胺单体的双键打开、活化形成自由基丙烯酰胺，从而引发聚合作用,。,（,2,）光聚合：通常采用核黄素作催化剂，核黄素在光照下光解成无色基，后者再被氧化成自由基而引发聚合作用。光聚合的凝胶孔径较大，而且随时间延长而逐渐变小，不太稳定。化学聚合的凝胶孔径较小，且各次制备的重复性好。故一般采用化学聚合。,聚丙烯酰胺凝胶的性质,三、实验步骤,一、安装垂直板型电泳装置,二、凝胶的制备,分离胶的制备,在一个干净的小烧杯中，按所列的试剂用量配制,。,SDS-,不连续系统,12,分离胶,浓度,，,10ml,体积配制量：,1.30%,凝胶贮液,4.0ml,2.,分离胶缓冲液,1.25ml,3.10%SDS 0.1ml,4.ddH2O 4.0ml,5.10%,过硫酸胺,0.06ml,6.2%TEMED 0.6 ml,浓缩胶的制备,在另一个干净的小烧杯中。,4.5,分离胶浓度，,5 ml,体积配制用量表：,1.30%,凝胶贮液,0.75mL,2.,浓缩胶缓冲液,0.83mL,3.10%SDS,0.1ml,4.ddH2O 3.0 mL,10%,过硫酸胺,0.03mL,2%TEMED,0.3 mL,分离胶,pH 8.8,加入浓缩胶溶液,pH6.8,制备浓缩胶,样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。,插入样品梳,牛血清白蛋白,样品,2,样品,1,蛋白,marker,样品,1,样品,2,牛血清白蛋白,两块胶一个电泳系统，两组共用：,第一组加样,第二组加样,第二块胶加样顺序与第一块胶相同,三加样,将,pH8.3,的电极缓冲溶液倒入上、下贮槽中，应没过短玻璃片。用微量注射器依次在各个样品凹槽内加样，一般加样体积为,10,15L,。如样品较稀，可加,20,30L,。由于样品溶解液中含有比重较大的甘油，故样品溶液会自动沉降在凝胶表面形成样品层。,四电泳,将上槽接负极，下槽接正极，打开电源，开始时将电流控制在,15,20 mA,待样品进入分离胶后，改为,30,50 mA,。待蓝色染料迁移至下端约,1,1.5 cm,时，停止电泳，约需,1,2,小时。恒压,(60V-90V),五剥胶,取下凝胶模子，将凝胶片取出，滑入一白瓷盘或大培养皿内。,六染色和脱色,染色 用一块胶，另一块胶用于转膜。,加入染色液，染色,45,分钟。,脱色,染色完毕，倾出染色液，加入脱色液。,20,30min,换一次脱色液，,2,3,次后可初步观察电泳条带，然后脱色过夜，直至背景清晰。,七、,Mr,的计算,标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。,以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量。,八转膜,胶放在,3,张缓冲液浸湿的滤纸上，盖上经甲醇激活（,15-30sec,）的,PVDF,膜（切多余的膜及纸，与凝胶一样大小）排气泡，盖同样,3,张缓冲液浸湿的滤纸，排气泡。,顺序：,负极,3,层滤纸凝胶膜,3,层滤纸正极，如图。,用塑料夹夹紧，放入转移电泳仪，电泳槽搁置冰上，恒压小时。丽春红染色,1,分钟检测目标蛋白。,九封闭,PVDF,膜用,TBST,淋洗，放入封闭液中,蛋白转膜组装顺序（,sandwich,制作）,组装顺序：,转膜夹,黑色面（负极）,海绵垫滤纸胶 膜 滤纸海绵垫,红色面（正极）,海绵,Cathode,_,Anode,+,滤纸,膜,胶,滤纸,海绵,醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质,【,基本原理,】,本实验用醋酸纤维薄膜作电泳支持物分离血清蛋白质。血清蛋白质的等电点都小于,7.5,，在,pH=8.6,的巴比妥缓冲溶液中都带有负电荷，在电场中将向正极移动。由于血清中各蛋白质的等电点不一，所带净电荷有差异，所以它们的泳动速率也不同。将微量血清点于薄膜上，通电电泳后，将薄膜置染色液中使蛋白质固定并染色，可将血清蛋白质分成,5,条区带，从正极端起分别为白蛋白、,1-,球蛋白、,2-,球蛋白、,-,球蛋白、,-,球蛋白。,【,操作步骤,】,一、准备与点样,1,将醋酸纤维薄膜切成,2.5 cm8 cm,的小片。在薄膜无光泽面距一端,1.5 cm,处用铅笔轻轻划一线，表示点样位置。,2,将醋酸纤维薄膜无光泽面向下，漂浮于巴比妥缓冲溶液面上（缓冲溶液盛于培养皿中），使膜条自然下沉。,3,将充分浸透（指膜上没有白色斑痕）的膜条取出，将薄膜无光泽面向上，平放在干净滤纸上，用干净滤纸吸去薄膜上多余的缓冲溶液。,4,将膜条（无光泽面向上）放于一干净滤纸上，用宽,1 cm,的有机玻片在盛有血清的小烧杯中蘸一下，使软片下端粘上薄层血清，然后按在薄膜点样线上，让血清渗入膜内，移开软片。,二、电泳,将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时无光泽面（即点样面）向下，点样端置于阴极（切勿弄错）。槽架上四层滤纸作桥垫，膜条与滤纸桥需贴紧并拉直，中间不能下垂。如一电泳槽中同时安放多张薄膜，则薄膜之间应相隔几毫米。盖上电泳槽盖，待平衡,5,分钟后通电，电压为,10 V/cm,长（指膜条与滤纸桥总长度），电流为,0.4,0.6 mA/cm,宽，电泳时间约,1,小时左右。,三、染色,通电完毕后用镊子将薄膜取出，直接浸于盛有氨基黑,10B,的染色液中，染,5,分钟取出，立即浸入盛有漂洗液的培养皿中，反复漂洗数次，直至背景漂净为止。用滤纸吸干薄膜。,