微生物与废物资源化.ppt

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第十二章微生物与废物资源化,微生物湿法冶金,微生物冶金的发展,微生物浸矿原理,冶金用浸矿微生物,微生物浸矿的影响因素,微生物浸矿工艺,9,菌体与矿物表面的相互作用,影响吸附效率的因素主要有：,）菌体的生理状态,）菌体表面的电荷,）胞外聚合物的影响,10,菌体内氧化还原酶的作用,浸出菌的呼吸链上，电子传递部位在细胞质膜上按特定部位排列。细菌体内存在的这种氧化酶氧化系统及其决定的氧化还原反应，都与呼吸链偶联，推动 的合成，提供细菌生理活动能量。,11,浸矿微生物目前大多数为化能自养型细菌，耐酸，在 值小于时仍能生存。以硫化细菌为最常见。,浸矿微生物可能存在的地点,矿山、矿堆、尾矿中流出的酸性水；被开采的矿石；温泉等。,12,冶金用浸矿微生物,生物质能,(biomass energy),太阳能以化学能形式贮存在生物质中的能量形式,即以生物质为载体的能量。它直接或间接地来源于绿色植物的光合作用,可转化为常规的固态、液态和气态燃料,微生物与可再生生物质能源,太阳能,生 物 质,光合生物,燃料酒精,生物氢,光合作用,生物光解,发酵制氢,发酵产酒精,太阳能固定,生物柴油,催化水解,微生物制氢技术,光解生物制氢,直接光解生物制氢,间接光解生物制氢,发酵生物制氢,光解制氢方法,1.,直接光解技术（蓝藻）,在厌氧条件下，可以利用氢作为电子供体用于二氧化碳的固定或释放氢气,绿色植物、绿藻、蓝细菌等,光合作用,light,6H,2,O+6CO,2,C,6,H,12,O,6,+6O,2,+,能量,光解与光合作用差别,绿藻的,光解作用产氢,氢化酶,hydrogenase,2H,+,+2e,H,2,蓝细菌和光合细菌,光解作用产氢,固氮酶,nitrogenase,N,2,+8H,+,+8e,-,+,能量,2NH,3,+,H,2,蓝藻光解水制氢机制,氢酶基因,Membrane-bound hydrogenase I,hynS,hynL,isp2,isp1,Membrane-bound hydrogenase II(H,2,-uptake),hupS,hupL,Soluble hydrogenase(H,2,-production),hoxF,Hox L,Hox S,hoxU,hoxE,氧对氢酶的严重抑制，必须将光合放氧和光合放氢在时间上或空间上分开，可以通过部分抑制,PSII,光化学活性来实现：,元素调控，如：硫、磷,PSII,抑制剂，如：,DCMU,、,CCCP,、,FCCP,代表性藻株有,:Chlamydomonas reinhardtii,产氢速率为：,7.95mmol H,2,/L,100h.,2.,间接光解产氢（蓝细菌）,固氮酶：催化还原氮气成氨，氢气作为副产物产生,吸氢酶：氧化由固氮酶催化产生的氢气,可逆氢酶：能够氧化合成氢气,发酵法生物制氢,Fermentative H,2,Production,产氢-产酸发酵细菌对碳水化合物的代谢途径,N.,Ren,B.Wang,J.C.Huang.,1997,Biotech.&Bioeng.,54(5):428,2H,2,2CH,3,(CH,2,),2,COOH,Butyrate,Carbohydrate,2CH,3,COCOH,Pyruvate,2CH,3,COSCoA,2ATP,2ADP,2FdH,2,2Fd,2CO,2,2NAD,+,2NADH+H,+,2NADH,+H,+,2NAD,+,2ADP,2ATP,2CH,3,COOH,Acetate,2CH,3,CH,2,OH,Ethanol,2CH,3,CH,2,COOH,Propionate,2CH,3,CHOHCOOH,Lactate,C,6,H,12,O,6,4NAD,+,4NADH,+H,+,2NAD,+,2NADH+H,+,ATP,2ATP,ADP,2ADP,4NAD,+,4NADH+H,+,2CO,2,C,6,H,12,O,6,2H,2,产氢,-,产酸发酵原理,经典生物产氢机理（一）,Gray,和,Gest,提出的梭杆菌型专性厌氧菌产氢,TPP,E,CH,3,COSCoA,HSCoA,丙酮酸脱氢酶,CH,3,COCOOH,CO,2,2Fe,2+,8FeFd,2Fe,3+,氢化酶,2H,+,H,2,TPP-E,：含硫胺素焦磷酸的氧化还原酶,CH,3,C,OH,TPP,E,2e,经典生物产氢机理（二）,Gray,和,Gest,提出的,肠杆菌型兼性厌氧菌产氢,Fd,：铁氧还蛋白酶,2e,HCOOH,2H,+,2Fe,2+,Fd,2Fe,3+,氢化酶,H,2,CO,2,CH,3,COCOOH,丙酮酸,-,甲酸裂解酶,CH,3,COSCoA,HSCOA,生物体内,NAD,+,/NADH,平衡调节释放,H,2,的方式：,NADH,+,H,+,NAD,+,+,H,2,G,o,=-21.84kJ/mol,经典生物产氢机理（三）,Tanisho,提出产氢,NADH,平衡调节产氢,发酵法生物产氢,H,2,理论产量,C,6,H,12,O,6,+2H,2,O,2CH,3,COOH+2CO,2,+,4H,2,Kalia,et al,said“Hydrogen is a strong contender as a future fuel.Biological hydrogen production ranges,from 0.37 to 3.3 mole-H,2,/mole-Glucose,and,considering the high theoretical values of production(,4.0 mole-H,2,/mole-Gglucose,),it is worth exploring approaches to increase hydrogen yields.”,TRENDS in Biotechnology Vol.21 No.4 April 2003,关键问题,:,提高产氢能力，利用廉价原料，,降低制氢成本,，适应商业化需求,菌种改良，建立高效产氢菌群,高效连续流反应器,基于代谢工程的高产氢收率的生化途径,开发廉价原料,方案一：代谢,阻断或基因敲除（代谢工程）,2H,2,2CH,3,(CH,2,),2,COOH,Butyrate,Carbohydrate,2CH,3,COCOH,Pyruvate,2CH,3,COSCoA,2ATP,2ADP,2FdH,2,2Fd,2CO,2,2NAD,+,2NADH+H,+,2NADH,+H,+,2NAD,+,2ADP,2ATP,2CH,3,COOH,Acetate,2CH,3,CH,2,OH,Ethanol,2CH,3,CH,2,COOH,Propionate,2CH,3,CHOHCOOH,Lactate,C,6,H,12,O,6,4NAD,+,4NADH,+H,+,2NAD,+,2NADH+H,+,ATP,2ATP,ADP,2ADP,4NAD,+,4NADH+H,+,2CO,2,C,6,H,12,O,6,2H,2,方案二：理想的生物产氢机理,(,代谢工程,),TPP-E,：含硫胺素焦磷酸的氧化还原酶,Fd,：铁氧还蛋白酶,实现,1mol,葡萄糖产生,6mol,氢气,CH,3,COCOOH,CHOOH,TPP,-,E,HSCoA,CH,3,C,OH,TPP,-,E,CH,3,COSCoA,2Fe,2+,8FeFd,2Fe,3+,氢化酶,2H,+,CO,2,2Fe,2+,2Fe,3+,氢化酶,2e,Fd,2H,+,H,2,H,2,2e,改良的脱氢酶系,方案三：生物发酵法与光解法耦联,分体耦联,底物梯级利用,一体耦联,互生关系,原理：发酵法生物制氢残液,(,有机酸和醇,),作为光解法生物制氢的供氢体,木质纤维素生物质能源化与资源化的系统工艺流程,生物质,糖化液,燃料酒精,残液,沼气,回用水,木质素 和残渣,有机肥,生物絮凝剂,燃烧为系统提供热源,H,2,糖化,发酵生物制氢,生产 乙醇,生产生物絮凝剂,厌氧产甲烷,废水深度处理,补充水,微生物燃料乙醇,植物的纤维素和半纤维素可作为乙醇发酵的原料。转化过程如图所示：,研究存在的问题,方面,存在的问题,水解酶,目前使用的纤维素酶都是由真菌产生的。,今后将着眼于厌氧分解菌,，由于这些细菌一般不分泌胞外酶，产能低，多数对结晶纤维素没活性。,糖化和发酵温度协调,在纤维素酶糖化过程中，,纤维素酶,最适温度在,50,左右，而,酵母发酵,控制温度在,37-40,。如何使这,两个过程的温度尽可能协调一致,。,固态发酵技术,固态发酵是使微生物在没有或几乎无游离水的固体培养基上生长代谢的过程，固态基质上水分以吸附水的形式存在。它的,发酵过程中无需严格的消毒，无需消耗大量能量分离提纯产品并且产率很高,。由于基质中水分很少，所以会大大降低染菌的机率。但是，固态发酵也有不足之处，发酵过程会产生大量的代谢热。,方面,存在的问题,酸水解,稀酸水解，,糖的转化率只能达到,50%,，其水解过程中产生一种络合物，是大多数微生物的抑制剂。,浓酸水解,，约有,90%,的纤维素和半纤维素转化的糖被回收，但是浓酸水解中的酸难以回收。,同时糖化发酵,同时糖化法的优点是显而易见的，但同时也有明显的限制因素，一是木糖的抑制作用，二是糖化和发酵时的最适温度不协调，三是酒精的抑制作用。,木糖的转化,将木糖及时转化为酒精，对高效率的酒精发酵是非常重要的。木糖的存在对纤维素酶水解纤维素有抑制作用，当木糖浓度达到,5%,时，木糖对纤维素酶的抑制可以达到,10%,。,针对野生型纤维素降解菌株进行改造策略,经典的微生物发酵产乙醇代谢路径图,基于代谢工程方法：,如采用基因敲除,(geneout),，,阻断有害代谢产物的生成途径,利用乙醇等刺激因子进行耐受诱导：,添加小剂量的乙醇，可以适当增强菌株在大量发酵时对乙醇的耐受性,构建重组基因工程菌：,扩大重组菌的底物利用范围，提高糖的利用率：引入戊糖代谢途径；将高效的产乙醇关键酶引入能代谢混合糖但乙醇产量低的菌种,Lee R.Lynd,et al,，,Microbial Cellulose Utilization:Fundamentals and Biotechnology.2002,66:548-549,针对无纤维素降解性能的乙醇发酵菌株的,工程菌构建改造策略,在细菌中异源表达纤维素酶,在运动发酵单胞菌中异源表达纤维素酶,在肠道细菌中异源表达纤维素酶,在真菌中异源表达纤维素酶,在酿酒酵母中异源表达纤维素酶,Lejeune,A.,D.E.Eveleigh,and C.Colson.,1988.Expression of an endoglucanasegene of,Pseudomonas fluorescens,var.,cellulosa,in,Zymomonas mobilis.,FEMS Microbiol.Lett.,49:,363366.,Skipper,N.,M.Sutherland,R.W.Davies,D.Kilburn,R.C.Miller,A.Warren,and R.Wong.,1985.Secretion of a bacterial cellulase by yeast.Science,230:,958961.,Hinchliffe,E.,and W.G.Box.,1984.Expression of the cloned endo-1,31,4-glucanase gene of,Bacillus subtilis,in,Saccharomyces cerevisiae.,Curr.Genet.,8:,471475.,微生物燃料乙醇,Bio-fuel Ethanol,举措与发展状况,美国,20,世纪,70,年代末，迫于石油危机，联邦政府制定了“乙醇发展计划”，开始大力推广车用乙醇汽油。,1999,年,8,月，克林顿政府宣布实施以农作物取代化石燃料的长期计划，到,2010,年，生物质能源的利用增长,2,倍。,日本,日本环境省的温室效应对策技术核心研讨会提议，国内的汽油汽车使用掺加酒精含量为,10,的混合燃料。另外,环境省计划于,2003,年推出试用车，,2008,年在日本普及。,巴西,1975,年推行车用乙醇汽油计划。,1991,年巴西政府再次颁布有关法令，规定在全国所有加油站的汽油中必须添加,20-24%,的无水酒精。,欧共体,积极发展车用乙醇汽油最直接的原因是解决农产品过剩问题。目前，在税收优惠政策的支持下，车用乙醇汽油的使用呈上升趋势。,一些国家的政策和举措,研究的历史沿革,1898,年,德国采用酸水解工艺从木头中得到了糖，并进行微生物发酵获得酒精，这是,最早期的生物质制酒精工艺,。,二战 期间,发现里氏木霉可以产生纤维素酶，从此开始利用酶进行生物质转化制取燃料乙醇的方法诞生。,1950-1970,水解与发酵分段法,(Separate Hydrolysis and Fermentation,SHF,),占主导,1970-2000,开发,同时糖化和发酵工艺,（,Simultaneous Saccharfication and Fermentation,separate pentose fermentation,，,SSF,）,2000-,至今,开发出,同时糖化和共发酵工艺,(Simultaneous Saccharification and Co-Fermentation,SSCF,）,未来 趋势,生物质直接转化乙醇的,一体化生物法,(Consolidated Bio-Processing,，,CBP,),，即生物质的水解和发酵是由同一种菌,发酵产乙醇代谢途径及,改造策略,经典的微生物发酵产乙醇代谢路径图,基于代谢工程方法：,如采用基因敲除,(geneout),，,阻断有害代谢产物的生成途径,利用乙醇等刺激因子进行耐受诱导：,添加小剂量的乙醇，可以适当增强菌株在大量发酵时对乙醇的耐受性,构建重组基因工程菌：,扩大重组菌的底物利用范围，提高糖的利用率：引入戊糖代谢途径；将高效的产乙醇关键酶引入能代谢混合糖但乙醇产量低的菌种,Lee R.Lynd,et al,，,Microbial Cellulose Utilization:Fundamentals and Biotechnology.2002,66:548-549,植物的纤维素和半纤维素可作为乙醇发酵的原料。转化过程如图所示：,研究存在的问题,方面,存在的问题,水解酶,目前使用的纤维素酶都是由真菌产生的。,今后将着眼于厌氧分解菌,，由于这些细菌一般不分泌胞外酶，产能低，多数对结晶纤维素没活性。,糖化和发酵温度协调,在纤维素酶糖化过程中，,纤维素酶,最适温度在,50,左右，而,酵母发酵,控制温度在,37-40,。如何使这,两个过程的温度尽可能协调一致,。,固态发酵技术,固态发酵是使微生物在没有或几乎无游离水的固体培养基上生长代谢的过程，固态基质上水分以吸附水的形式存在。它的,发酵过程中无需严格的消毒，无需消耗大量能量分离提纯产品并且产率很高,。由于基质中水分很少，所以会大大降低染菌的机率。但是，固态发酵也有不足之处，发酵过程会产生大量的代谢热。,方面,存在的问题,酸水解,稀酸水解，,糖的转化率只能达到,50%,，其水解过程中产生一种络合物，是大多数微生物的抑制剂。,浓酸水解,，约有,90%,的纤维素和半纤维素转化的糖被回收，但是浓酸水解中的酸难以回收。,同时糖化发酵,同时糖化法的优点是显而易见的，但同时也有明显的限制因素，一是木糖的抑制作用，二是糖化和发酵时的最适温度不协调，三是酒精的抑制作用。,木糖的转化,将木糖及时转化为酒精，对高效率的酒精发酵是非常重要的。木糖的存在对纤维素酶水解纤维素有抑制作用，当木糖浓度达到,5%,时，木糖对纤维素酶的抑制可以达到,10%,。,发展趋势及热点,目前，以纤维素原料制取燃料酒精的研究热点是,一体化生物工艺,(Consolidated Bio-Processing,CBP,固定化酶糖化发酵法,),，即生物质的水解和发酵是由一种菌完成的。在酶水解方法中，酶的成本太高，而,CBP,的优点是不必生产纤维素酶，从而大大降低了生产成本。,Lynd,L.R.,R.T.Elander,and C.E.Wyman.1996.Likely features and costs of mature biomass ethanol technology.,Appl.Biochem.Biotechnol,.5758:741761.,针对无纤维素降解性能的乙醇发酵菌株的,工程菌构建改造策略,在细菌中异源表达纤维素酶,在运动发酵单胞菌中异源表达纤维素酶,在肠道细菌中异源表达纤维素酶,在真菌中异源表达纤维素酶,在酿酒酵母中异源表达纤维素酶,Lejeune,A.,D.E.Eveleigh,and C.Colson.,1988.Expression of an endoglucanasegene of,Pseudomonas fluorescens,var.,cellulosa,in,Zymomonas mobilis.,FEMS Microbiol.Lett.,49:,363366.,Skipper,N.,M.Sutherland,R.W.Davies,D.Kilburn,R.C.Miller,A.Warren,and R.Wong.,1985.Secretion of a bacterial cellulase by yeast.Science,230:,958961.,Hinchliffe,E.,and W.G.Box.,1984.Expression of the cloned endo-1,31,4-glucanase gene of,Bacillus subtilis,in,Saccharomyces cerevisiae.,Curr.Genet.,8:,471475.,生物柴油,Biodiesel,生物柴油是一种以植物油、动物脂肪为主要原料，性质和普通柴油十分相似的燃油,生物柴油的优点,来源于生物质，可再生,燃烧后产生的,CO,2,、,CO,及有毒物质含量低，不含硫，不产生,SOx,污染问题,本身无毒、无害，能自行分解,闪点较高，运输和存储安全,生物柴油概述,生物柴油主要成分为脂肪酸甲酯，通过植物油,(,棉籽油、棕榈油、椰子油、菜籽油、野生植物油以及海藻等,),与甲醇酯交换制得,酯交换,(,醇解,),法反应机理,CH,2,OCOR1,CH,2,OCOR3,CH,2,OCOR2+3CH,3,OH,CH,2,OH,CH,2,OH +,CH,2,OH,催化剂,CH,3,OCOR1,CH,3,OCOR3,CH,3,OCOR2,生物柴油的制备原理,工艺复杂、反应温度高、生产成本高,排放废液、产生二次污染,后续处理麻烦、产品分离困难,原料中的水分和游离脂肪酸对产品的收率和品质有负面影响,传统工艺的缺点,优点：,反应条件温和、醇用量小、催化剂易分离、甘油易回收以及不发生副反应。,存在的技术问题：,脂肪酶催化效率不高,酶的寿命低，反应物甲醇容易导致酶失活，副产物甘油影响酶反应活性及稳定性,酶制剂成本高,制备新技术：,生物酶催化酯交换工艺,生物酶催化剂的应用形式,脂肪酶的固定化技术,全细胞生物催化剂技术,具有良好的发展前景,优点：,脂肪酶固定化技术具有稳定性高、可重复使用；能提高酶的催化活性；容易从产品中分离等。,研究重点：,解决固定化脂肪酶易失活的问题，以增加其实际应用价值。,脂肪酶固定化技术,优点：,无需酶的提取纯化，节省成本,经过简单培养就能制取，且分离简单,产生脂肪酶的絮凝性微生物，在培养中能自发地固定在载体上，省却了人为的固定化过程,国内外研究热点：,寻找表达脂肪酶的合适的细胞载体,通过基因技术提高脂肪酶表达水平,在胞外构建脂肪酶的技术,增加载体通透性的处理方法,酶催化剂新的应用形式：,全细胞生物催化剂,Kazuhiro Ban e tal,Biochemical Engineering Journal 8(2001),全细胞催化剂在生物支撑颗粒（,BSP,）的表面和横断面显微照片,许多微藻种类能够在生长晚期积累油脂，而藻油可以被转化为生物柴油，成为化石能源的优良替代品。该学科组通过基因工程改造促进藻细胞产油，并试图以蓝藻和其他微藻直接合成生物柴油。,微藻,Botryococcusbraunii,，,油脂含量为,50,70,酵母类的,Cryptococcusalbidus,（,浅白色隐球酵母），油脂含量为,65,；,Rhodotorulaglutinis,（,胶粘红酵母），油脂含量为,72,；,霉菌类的,Aspregillusterreus,（,土曲霉），油脂含量为,57,；,Mortierellaalpina,（,高山被孢霉），油脂含量为,40,产油微生物,