GB 5009.82-2016 食品安全国家标准 食品中维生素A、D、E的测定.pdf
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1、中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B5 0 0 9 .8 22 0 1 6食品安全国家标准食品中维生素A、D、E的测定2 0 1 6 - 1 2 - 2 3发布2 0 1 7 - 0 6 - 2 3实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局发 布G B5 0 0 9.8 22 0 1 6 前 言 本标准代替G B/T5 0 0 9.8 22 0 0 3 食品中维生素A和维生素E的测定 、G B5 4 1 3.92 0 1 0 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E的测定 、G B/T9 6 9 5.2 62 0 0 8 肉
2、与肉制品 维生素A含量测定 、G B/T9 6 9 5.3 02 0 0 8 肉与肉制品 维生素E含量测定 、NY/T1 5 9 82 0 0 8 食用植物油中维生素E组分和含量的测定 高效液相色谱法 。本标准与G B/T5 0 0 9.8 22 0 0 3相比, 主要变化如下: 标准名称修改为“ 食品安全国家标准 食品中维生素A、D、E的测定” ; 增加了“ 食品中维生素E的测定 正相高效液相色谱法” ; 增加了“ 食品中维生素D的测定 液相色谱-串联质谱法” ; 增加了“ 食品中维生素D的测定 高效液相色谱法” ; 修改了“ 食品中维生素A和维生素E的测定 反相高效液相色谱法” ; 修改了
3、维生素E异构体的反相色谱分离条件, 可同时分离测定4种生育酚异构体; 删除了苯并芘内标定量法, 改用外标法定量; 删除了“ 比色法” 测定维生素A。G B5 0 0 9.8 22 0 1 61 食品安全国家标准食品中维生素A、D、E的测定1 范围本标准规定了食品中维生素A、 维生素E和维生素D的测定方法。本标准第一法适用于食品中维生素A和维生素E的测定。本标准第二法适用于食用油、 坚果、 豆类和辣椒粉等食物中维生素E的测定。本标准第三法适用于食品中维生素D2和维生素D3的测定。本标准第四法适用于配方食品中维生素D2或维生素D3的测定。第一法 食品中维生素A和维生素E的测定 反相高效液相色谱法2
4、 原理试样中的维生素A及维生素E经皂化( 含淀粉先用淀粉酶酶解) 、 提取、 净化、 浓缩后,C3 0或P F P反相液相色谱柱分离, 紫外检测器或荧光检测器检测, 外标法定量。3 试剂和材料除非另有说明, 本方法所用试剂均为分析纯, 水为G B/T6 6 8 2规定的一级水。3.1 试剂3.1.1 无水乙醇(C2H5OH) : 经检查不含醛类物质, 检查方法参见A.1。3.1.2 抗坏血酸(C6H8O6) 。3.1.3 氢氧化钾(KOH) 。3.1.4 乙醚 (CH3CH2)2O : 经检查不含过氧化物, 检查方法参见A.2。3.1.5 石油醚(C5H1 2O2) : 沸程为3 06 0。3
5、.1.6 无水硫酸钠(N a2S O4) 。3.1.7 p H试纸(p H范围11 4) 。3.1.8 甲醇(CH3OH) : 色谱纯。3.1.9 淀粉酶: 活力单位1 0 0U/m g。3.1.1 0 2,6 -二叔丁基对甲酚(C1 5H2 4O) : 简称B HT。3.2 试剂配制3.2.1 氢氧化钾溶液(5 0g/1 0 0g) :称取5 0g氢氧化钾, 加入5 0m L水溶解, 冷却后, 储存于聚乙烯瓶中。3.2.2 石油醚-乙醚溶液(1+1) : 量取2 0 0m L石油醚, 加入2 0 0m L乙醚, 混匀。G B5 0 0 9.8 22 0 1 62 3.2.3 有机系过滤头(
6、孔径为0.2 2m) 。3.3 标准品3.3.1 维生素A标准品视黄醇(C2 0H3 0O,C A S号:6 8 - 2 6 - 8) : 纯度9 5%, 或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。3.3.2 维生素E标准品3.3.2.1 -生育酚(C2 9H5 0O2,C A S号:1 0 1 9 1 - 4 1 - 0) : 纯度9 5%, 或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。3.3.2.2 -生育酚(C2 8H4 8O2,C A S号:1 4 8 - 0 3 - 8) :纯度9 5%, 或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。3.3.2.3 -生育酚(C2 8H4 8O2,C A
7、 S号:5 4 - 2 8 - 4) : 纯度9 5%, 或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。3.3.2.4 -生育酚(C2 7H4 6O2,C A S号:1 1 9 - 1 3 - 1) : 纯度9 5%, 或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。3.4 标准溶液配制3.4.1 维生素A标准储备溶液(0.5 0 0m g/m L) : 准确称取2 5.0m g维生素A标准品 , 用无水乙醇溶解后, 转移入5 0m L容量瓶中, 定容至刻度, 此溶液浓度约为0.5 0 0m g/m L。将溶液转移至棕色试剂瓶中, 密封后, 在-2 0下避光保存, 有效期1个月。临用前将溶液回温至2 0
8、, 并进行浓度校正( 校正方法参见附录B) 。3.4.2 维生素E标准储备溶液(1.0 0m g/m L) : 分别准确称取 -生育酚、-生育酚、 -生育酚和-生育酚各5 0.0m g, 用无水乙醇溶解后, 转移入5 0m L容量瓶中, 定容至刻度, 此溶液浓度约为1.0 0m g/m L。将溶液转移至棕色试剂瓶中, 密封后, 在-2 0 下避光保存, 有效期6个月。临用前将溶液回温至2 0, 并进行浓度校正( 校正方法参见附录B) 。3.4.3 维生素A和维生素E混合标准溶液中间液: 准确吸取维生素A标准储备溶液1.0 0m L和维生素E标准储备溶液各5.0 0m L于同一5 0m L容量瓶
9、中, 用甲醇定容至刻度, 此溶液中维生素A浓度为1 0.0g/m L, 维生素E各生育酚浓度为1 0 0g/m L。在-2 0下避光保存, 有效期半个月。3.4.4 维生素A和维生素E标准系列工作溶液: 分别准确吸取维生素A和维生素E混合标准溶液中间液0.2 0m L、0.5 0m L、1.0 0m L、2.0 0m L、4.0 0m L、6.0 0m L于1 0m L棕色容量瓶中, 用甲醇定容至刻度, 该 标 准 系 列 中 维 生 素A浓 度 为0. 2 0g/m L、0. 5 0g/m L、1. 0 0g/m L、2. 0 0g/m L、4.0 0g/m L、6.0 0g/m L, 维生
10、素E浓度为2. 0 0g/m L、5. 0 0g/m L、1 0. 0g/m L、2 0. 0g/m L、4 0.0g/m L、6 0.0g/m L。临用前配制。4 仪器和设备4.1 分析天平: 感量为0.0 1m g。4.2 恒温水浴振荡器。4.3 旋转蒸发仪。4.4 氮吹仪。4.5 紫外分光光度计。4.6 分液漏斗萃取净化振荡器。G B5 0 0 9.8 22 0 1 63 4.7 高效液相色谱仪: 带紫外检测器或二极管阵列检测器或荧光检测器。5 分析步骤5.1 试样制备将一定数量的样品按要求经过缩分、 粉碎均质后, 储存于样品瓶中, 避光冷藏, 尽快测定。5.2 试样处理警示: 使用的所
11、有器皿不得含有氧化性物质; 分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油; 处理过程应避免紫外光照, 尽可能避光操作; 提取过程应在通风柜中操作。5.2.1 皂化5.2.1.1 不含淀粉样品称取2g5g( 精确至0.0 1g) 经均质处理的固体试样或5 0g( 精确至0.0 1g) 液体试样于1 5 0m L平底烧瓶中, 固体试样需加入约2 0m L温水, 混匀, 再加入1.0g抗坏血酸和0.1gB HT, 混匀, 加入3 0m L无水乙醇, 加入1 0m L2 0m L氢氧化钾溶液, 边加边振摇, 混匀后于8 0 恒温水浴震荡皂化3 0m i n, 皂化后立即用冷水冷却至室温。注:皂化时间一般为3 0m i
12、 n, 如皂化液冷却后, 液面有浮油, 需要加入适量氢氧化钾溶液, 并适当延长皂化时间。5.2.1.2 含淀粉样品称取2g 5g( 精确至0.0 1g) 经均质处理的固体试样或5 0g( 精确至0.0 1g) 液体样品于1 5 0m L平底烧瓶中, 固体试样需用约2 0m L温水混匀, 加入0.5g1g淀粉酶, 放入6 0水浴避光恒温振荡3 0m i n后, 取出, 向酶解液中加入1.0g抗坏血酸和0.1gB HT, 混匀, 加入3 0m L无水乙醇,1 0m L2 0m L氢氧化钾溶液, 边加边振摇, 混匀后于8 0恒温水浴振荡皂化3 0m i n, 皂化后立即用冷水冷却至室温。5.2.2
13、提取将皂化液用3 0m L水转入2 5 0m L的分液漏斗中, 加入5 0 m L石油醚-乙醚混合液, 振荡萃取5m i n, 将下层溶液转移至另一2 5 0m L的分液漏斗中, 加入5 0m L的混合醚液再次萃取, 合并醚层。注:如只测维生素A与-生育酚, 可用石油醚作提取剂。5.2.3 洗涤用约1 0 0m L水洗涤醚层, 约需重复3次, 直至将醚层洗至中性( 可用p H试纸检测下层溶液p H值) , 去除下层水相。5.2.4 浓缩将洗涤后的醚层经无水硫酸钠( 约3g) 滤入2 5 0m L旋转蒸发瓶或氮气浓缩管中, 用约1 5m L石油醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠2次, 并入蒸发瓶内, 并
14、将其接在旋转蒸发仪或气体浓缩仪上, 于4 0水浴中减压蒸馏或气流浓缩, 待瓶中醚液剩下约2m L时, 取下蒸发瓶, 立即用氮气吹至近干。用甲醇分次将蒸发瓶中残留物溶解并转移至1 0m L容量瓶中, 定容至刻度。溶液过0.2 2m有机系滤膜后供高效液相色谱测定。G B5 0 0 9.8 22 0 1 64 5.3 色谱参考条件色谱参考条件列出如下:a) 色谱柱:C3 0柱( 柱长2 5 0mm, 内径4.6mm, 粒径3m) , 或相当者;b) 柱温:2 0;c) 流动相:A: 水;B: 甲醇, 洗脱梯度见表1;d) 流速:0.8m L/m i n;e) 紫外检测波长: 维生素A为3 2 5n
15、m; 维生素E为2 9 4n m;f) 进样量:1 0L;g) 标准色谱图和样品色谱图见C.1。注1:如难以将柱温控制在2 02, 可改用P F P柱分离异构体, 流动相为水和甲醇梯度洗脱。注2:如样品中只含 -生育酚, 不需分离-生育酚和-生育酚, 可选用C1 8柱, 流动相为甲醇。注3:如有荧光检测器, 可选用荧光检测器检测, 对生育酚的检测有更高的灵敏度和选择性, 可按以下检测波长检测: 维生素A激发波长3 2 8n m, 发射波长4 4 0n m; 维生素E激发波长2 9 4n m, 发射波长3 2 8n m。表1 C3 0色谱柱-反相高效液相色谱法洗脱梯度参考条件时间m i n流动相
16、A%流动相B%流速m L/m i n0.049 60.81 3.049 60.82 0.001 0 00.82 4.001 0 00.82 4.549 60.83 0.049 60.85.4 标准曲线的制作本法采用外标法定量。将维生素A和维生素E标准系列工作溶液分别注入高效液相色谱仪中, 测定相应的峰面积, 以峰面积为纵坐标, 以标准测定液浓度为横坐标绘制标准曲线, 计算直线回归方程。5.5 样品测定试样液经高效液相色谱仪分析, 测得峰面积, 采用外标法通过上述标准曲线计算其浓度。在测定过程中, 建议每测定1 0个样品用同一份标准溶液或标准物质检查仪器的稳定性。6 分析结果的表述试样中维生素A
17、或维生素E的含量按式(1) 计算:X=Vf1 0 0m(1) 式中:X 试样中维生素A或维生素E的含量, 维生素A单位为微克每百克(g/1 0 0 g) , 维生素E单位为毫克每百克(m g/1 0 0 g) ; 根据标准曲线计算得到的试样中维生素A或维生素E的浓度, 单位为微克每毫升(g/m L) ;G B5 0 0 9.8 22 0 1 65 V 定容体积, 单位为毫升(m L) ;f 换算因子( 维生素A:f=1; 维生素E:f=0.0 0 1) ;1 0 0 试样中量以每1 0 0克计算的换算系数;m 试样的称样量, 单位为克(g) 。计算结果保留三位有效数字。注:如维生素E的测定结果
18、要用 -生育酚当量(- T E) 表示, 可按下式计算: 维生素E(m g- T E/1 0 0g)=-生育酚(m g/1 0 0g)+-生育酚(m g/1 0 0g)0.5+-生育酚(m g/1 0 0g)0.1+-生育酚(m g/1 0 0g)0.0 1。7 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的1 0%。8 其他当取样量为5g, 定容1 0m L时, 维生素A的紫外检出限为1 0g/1 0 0g, 定量限为3 0g/1 0 0g; 生育酚的紫外检出限为4 0g/1 0 0g, 定量限为1 2 0g/1 0 0g。第二法 食品中维生素E的测定 正相高效液相
19、色谱法9 原理试样中的维生素E经有机溶剂提取、 浓缩后, 用高效液相色谱酰氨基柱或硅胶柱分离, 经荧光检测器检测, 外标法定量。1 0 试剂和材料除非另有说明, 本方法所用试剂均为分析纯。水为G B/T6 6 8 2规定的一级水。1 0.1 试剂1 0.1.1 无水乙醇(C2H5OH) : 色谱纯, 经检验不含醛类物质, 检查方法参见A.1。1 0.1.2 乙醚 (CH3CH2)2O : 分析纯, 经检验不含氧化物, 检查方法参见A.2。1 0.1.3 石油醚(C5H1 2O2) : 沸程为3 06 0。1 0.1.4 无水硫酸钠(N a2S O4) 。1 0.1.5 正己烷(n- C6H1
20、4) : 色谱纯。1 0.1.6 异丙醇 (CH3)2CHOH : 色谱纯。1 0.1.7 叔丁基甲基醚 CH3O C(CH3)3 : 色谱纯。1 0.1.8 甲醇(CH3OH) : 色谱纯。1 0.1.9 四氢呋喃(C4H8O) : 色谱纯。1 0.1.1 0 1,4 -二氧六环(C4H8O2) : 色谱纯。1 0.1.1 1 2,6 -二叔丁基对甲酚(C1 5H2 4O) : 简称B HT。1 0.1.1 2 有机系过滤头( 孔径为0.2 2m) 。G B5 0 0 9.8 22 0 1 66 1 0.2 试剂配制1 0.2.1 石油醚-乙醚溶液(1+1) : 量取2 0 0m L石油醚,
21、 加入2 0 0m L乙醚, 混匀, 临用前配制。1 0.2.2 流动相: 正己烷+ 叔丁基甲基醚-四氢呋喃-甲醇混合液(2 0+1+0.1) =9 0+1 0, 临用前配制。1 0.3 标准品1 0.3.1 -生育酚(C2 9H5 0O2,C A S号:1 0 1 9 1 - 4 1 - 0) : 纯度9 5%, 或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质;1 0.3.2 -生育酚(C2 8H4 802,C A S号:1 4 8 - 0 3 - 8) :纯度9 5%, 或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质;1 0.3.3 -生育酚(C2 8H4 802,C A S号:5 4 - 2 8 -
22、 4) : 纯度9 5%, 或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质;1 0.3.4 -生育酚(C2 7H4 602,C A S号:1 1 9 - 1 3 - 1) : 纯度9 5%, 或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。1 0.4 标准溶液配制1 0.4.1 维生素E标准储备溶液(1.0 0m g/m L) : 分别称取4种生育酚异构体标准品各5 0.0m g( 准确至0.1m g) , 用无水乙醇溶解于5 0m L容量瓶中, 定容至刻度, 此溶液浓度约为1.0 0m g/m L。将溶液转移至棕色试剂瓶中, 密封后, 在-2 0下避光保存, 有效期6个月。临用前将溶液回温至2 0, 并
23、进行浓度校正( 校正方法参见附录B) 。1 0.4.2 维生素E标准溶液中间液: 准确吸取维生素E标准储备溶液各1.0 0m L于同一1 0 0m L容量瓶中, 用氮气吹除乙醇后, 用流动相定容至刻度, 此溶液中维生素E各生育酚浓度为1 0.0 0g/m L。密封后, 在-2 0下避光保存, 有效期半个月。1 0.4.3 维生素E标准系列工作溶液: 分别准确吸取维生素E混合标准溶液中间液0.2 0m L、0.5 0m L、1.0 0m L、2.0 0m L、4.0 0m L、6.0 0m L于1 0m L棕色容量瓶中, 用流动相定容至刻度, 该标准系列中4种生育酚浓度分别为0.2 0g/m L
24、、0.5 0g/m L、1.0 0g/m L、2.0 0g/m L、4.0 0g/m L、6.0 0g/m L。1 1 仪器和设备 1 1.1 分析天平: 感量为0.1m g。1 1.2 恒温水浴振荡器。1 1.3 旋转蒸发仪。1 1.4 氮吹仪。1 1.5 紫外分光光度计。1 1.6 索氏脂肪抽提仪或加速溶剂萃取仪。1 1.7 高效液相色谱仪, 带荧光检测器或紫外检测器。1 2 分析步骤1 2.1 试样制备将一定数量的样品按要求经过缩分、 粉碎、 均质后, 储存于样品瓶中, 避光冷藏, 尽快测定。G B5 0 0 9.8 22 0 1 67 1 2.2 试样处理警示: 使用的所有器皿不得含有
25、氧化性物质; 分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油; 处理过程应避免紫外光照, 尽可能避光操作。1 2.2.1 植物油脂称取0.5g 2g油样( 准确至0.0 1g) 于2 5m L的棕色容量瓶中, 加入0.1gB HT, 加入1 0m L流动相超声或涡旋振荡溶解后, 用流动相定容至刻度, 摇匀。过孔径为0.2 2m有机系滤头于棕色进样瓶中, 待进样。1 2.2.2 奶油、 黄油称取2g 5g样品( 准确至0.0 1g) 于5 0m L的离心管中, 加入0.1gB HT,4 5 水浴融化, 加入5g无水硫酸钠, 涡旋1m i n, 混匀, 加入2 5m L流动相超声或涡旋振荡提取, 离心, 将上清液转
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